老年性痴呆模型大鼠海马区Bcl2、Bax的表达及七福饮的干预作用.doc

1 老年性痴呆模型大鼠海马区 Bcl 拟2、 Bax 的表达及七福饮的干预作用作者:兴桂华李雪岩林春荣胡南牛英才【摘要】目的探讨β拟淀粉样蛋白(Aβ1拟 42) 诱导的老年性痴呆( AD ) 模型大鼠 Bcl 拟2、 Bax 的表达及七福饮对其的干预作用。方法采用海马立体定向注射凝聚态 Aβ1拟 42 制备 AD 大鼠实验动物模型, 药物干预 4w 后应用实时定量 PCR 法检测 Bcl 拟2 mRNA 及 Bax mRNA 的表达。采用免疫组织化学染色和计算机图像分析技术测定海马区 Bcl 拟 2、 Bax 蛋白阳性目标积分光密度。结果与假手术对照组比较, 模型组 Bax mRNA 和蛋白表达水平显著升高,而 Bcl 拟2 mRNA 和蛋白表达水平显著降低。与模型组比较, 盐酸多奈哌齐组、七福饮各剂量组 Bax mRNA 和蛋白表达显著降低, 而七福饮各剂量组 Bcl 拟2 mRNA 和蛋白表达显著升高( )。结论大脑海马注射 Aβ1拟 42 后大鼠海马组织 Bax 表达明显增高, Bcl 拟2 表达明显降低, 七福饮可抑制海马组织 Bax 表达, 促进 Bcl 拟2 表达, 为七福饮抗 AD 的作用机制之一。 2 【关键词】老年性痴呆; 七福饮; 免疫组化; 细胞凋亡; 实时荧光定量 PCR 研究表明,神经细胞的凋亡是 AD 发生的一个重要机制〔 1〕。近年研究证实,某些中药复方可通过抑制 AD 大鼠海马组织 Bax 基因的表达和促进 Bcl 拟2 基因的表达,减少神经细胞凋亡, 达到抗 AD 的作用〔2~4〕。七福饮为传统经典名方,出自张景岳《景岳全书》,对痴呆病有一定的临床疗效〔 5,6〕。本实验采用海马注射 Aβ1拟 42 诱导 AD 大鼠模型,通过实时定量 PCR 和免疫组化法检测凋亡相关基因 Bax 和 Bcl 拟2 表达, 并观察七福饮的干预作用, 为七福饮临床治疗 AD 提供理论佐证。 1 材料与方法 实验药物七福饮饮片购自齐齐哈尔市药材公司中药饮片厂长春堂药店。采用水提醇法制备七福饮浓缩液:七福饮饮片加 6 倍量蒸馏水煎煮 2次, 每次 h, 合并滤液, 滤过滤液浓缩至相对浓度 ( 50℃~ 60℃) ;加入乙醇使醇含量达 65% , 3 冷藏 24h, 醇液滤过, 滤液回收乙醇, 至无醇味; 合并药液滤过;滤液冷藏放置,视无沉淀析出;添加蒸馏水,调 pH 值至 ~ , 并调整至相当于含生药 2 g/ml ; 精滤、灌封、灭菌即得。盐酸多奈哌齐片由法国 PFIZER PGM 公司制造, 产品批号 5136903 。Aβ1拟 42 为北京中杉金桥生物技术有限公司产品,使用前用无菌生理盐水稀释成 10μ g/μl, 37℃孵育1w ,使其变为聚集状态的 Aβ。 实验动物健康雄性清洁级 SD 大鼠 84 只购于北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证编号 SCXK (京) 2002 拟 0003 , 体重(280 ± 10) g, 适应性饲养 1w, 随机分为 7组: 空白对照组、假手术对照组、模型组、盐酸多奈哌齐组和 3 个剂量七福饮组,每组 12 只。 主要试剂及仪器荧光定量 PCR 试剂盒( SYBR 飡)及 Total RNA 提取试剂均为 TAKARA 公司产品, 焦碳酸二乙酯( DEPC ) 为瑞兴化学产品。兔 anti 拟 Bcl 拟2、总 anti 拟 Bax 抗体购于武汉博士德生物工程有限公司, 即用型免疫组化染色( SP ) 试剂盒及 4 二氨基联苯***( DAB ) 显色剂均购于福州迈新生物技术公司。 ABI730 0 荧光定量 PC R 仪为美国 AB I 公司产品, 270 0型 PCR System 扩增仪为 Applied Biosystems 公司产品。 UV 拟 255 0 型紫外分光光度计为日本岛津产品。 方法 动物模型的制备〔 7〕实验大鼠 1% 戊巴比妥钠( 40 mg/kg )麻醉后,立体定位仪固定头部,备皮消毒,沿颅顶中线作 2 cm 切口,分离骨膜使头骨暴露,于前囟向后 mm ,中线左右各旁开 mm , 用牙科钻打开颅骨, 垂直进微量进样器 mm ,将1μl 溶液缓慢注入, 注射时间 5 min , 留针 5 min , 模型组、盐酸多奈哌齐组、七福饮各剂量组左右侧海马各注射 1μlAβ1拟 42(10 μ g) 溶液,假手术对照组注射 1μl 生理盐水。 药物干预造模后 3d 开始给药, 根据人和动物按体表面积折算等效剂量。盐酸多奈哌齐组按 mg/kg ,1次/d 灌胃,各实验组分别按 、 和 mg · kg-