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【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）
双酶切连接反应之全攻略
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会， 结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序……… 希望大家不断补充。
Ding 一下，和我的方法差不多。
连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase。
springwel wrote:
用2周重组了 14个质粒。
这个效率非常不错！佩服!
smartkevin wrote:
Ding 一下，和我的方法差不多。
连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase。
这个操作是什么原理？为什么要选择45C？
其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。
分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：
插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处 理是其粘性末端打开。由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。
springwel wrote:
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 p l反应液中，30°C温度下反应1小时，将1 p g的入DNA 完全分解的酶量定义为1个活性单位（U）。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15p g的DNA， 而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3p g，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3p g，所以即便全部加进去，只要纯化的质 量好，酶切完全切得动。
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但是公司给推荐的一般都是2。0ul体系加1ul，其实我有的时候为了省酶，，切的也很好。
我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA 一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多 钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。
smartkevin wrote: 其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。
分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下:
插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处 理是其粘性末端打开。由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。
如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用。不知道还有没有其他的解释？ 我倒是没有仔细看过分子克隆。
mybbff wrote:
如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用。不知道还有没有其他的解释？
我倒是没有仔细看过分子克隆。
刚才查了一下分子克隆3,只说了一句“以消除重新复性而导致的末端相互聚合”（中文版p71）。
其实如果是粘性末端酶切的话都是有用的，无所谓非同源和同源末端，就算是非同源末端，载体和载体，片段和片段也能聚合。
对于平末端应该就没有什么作用了。
autumnsun wrote:
但是公司给推荐的一般都是2。0ul体系加1ul，其实我有的时候为了省酶，，切的也很好。
我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA 一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多
钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。
如果100ul里的DNA太多了也不行啊，酶和DNA还是要匹配的
我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA 一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多
钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。
其实除了考虑酶浓度（每微升多少个单位）以外，还应该考虑这种酶在lamda DNA上的酶切位点数目。比如用HincII和XbaI 双切pUC118,这两个酶在pUC118上都只有一个酶切位点，而在lamda DNA上的酶切位点分别是35个和1个。根据酶活性的定
义，相同单位的HincII和XbaI对pUC118的酶切