ludin和ZO1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹中的表达的论文.doc

ludin和ZO1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹中的表达的论文.docludin和ZO1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹中的表达的论文


【摘要】目的: 研究 ludin,zo1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹中的表达. 方法: 成年健康杂色豚鼠,耳廓反射灵敏,分别取耳蜗、脑、肺三组组织,免疫组织化学法及g/kg)腹腔麻醉,新鲜配置的40 g/l多聚甲醛灌注后断头,取出双耳听泡,刺开蜗尖及圆窗膜,灌注蜗尖数次,将耳蜗取出置入40 g/l多聚甲醛中,4℃中放置24 h后100 g/l edta脱钙14 d,同时取脑皮质及肺组织投入40 g/l多聚甲醛中24 h后700 ml/l乙醇室温保存. 石蜡包埋后沿蜗轴行平行切片, 切片厚度5 μm,取三种组织的三套石蜡切片分别进行antizo1,antioccludin和阴性对照染色切片,脱蜡、水化,pbs洗后分别加入一抗(zymed laboratories,美国),包括zo1兔多克隆抗体(1∶100)ludin兔多克隆抗体(1∶100),4℃过夜;pbs洗;滴加羊抗兔二抗(sigma,美国,1∶200),37℃孵育2 h;滴加链霉素卵白素过氧化物酶(abc),37℃孵育1 h,pbs冲洗;dab显色,自来水冲洗,脱水,透明,封片,在光镜下观察. 阴性对照实验采用pbs代替一抗,其余步骤同上.
)腹腔麻醉后迅速断头,取出双耳听泡,在体视显微镜下迅速取出耳蜗外侧壁血管纹,同时取出脑皮质及肺,mol/l tris, ph , nacl, naf,焦磷酸钠,蔗糖,plete, mini, edtafree药片(roche diagnostics,德国),冰上充分匀浆,12 000 g,4℃,离心5 min,收集上清. 考马斯亮蓝检测三组蛋白的含量. 按照每泳道5 μg加载于sdspage凝胶电泳孔中,以恒压120 v/40 ma电泳至溴酚蓝到达凝胶底边. 恒流300 ma转印于nc膜上. 丽春红染色,tbst缓冲液配置的50 g/l脱脂奶粉室温下封闭2 h. 三组分别加入兔抗豚鼠zo1一抗(1 μg/ml),ludin一抗(2 mg/l, zymed laboratories,美国)及兔抗actin(santa cruz,美国,1∶200),4℃过夜,tbst缓冲液洗膜2次,每次10 min,tbs缓冲液洗膜1次,10 min,加入hrp标记的二抗(北京中衫,1∶5000),37℃孵育1 h,洗膜3次,每次10 min. ecl化学发光系统(pierce)ludin,zo1及βactin的蛋白表达水平. 分析阳性条带的分子量大小,用tanon高清晰度计算机图像分析系统进行灰度扫描分析,根据信号的强弱分析蛋白的表达量. 以目的条带与βactin内参条带灰度的比值代表蛋白质表达水平.
统计学处理:数据均用x±s表示,采用spss , 应用 oner 220 000,60 000,43 000出现阳性条带. 计算机灰度扫描软件分析灰度值(图3).
3讨论
正常耳蜗微血管内皮细胞通透性对保证blb微环境的稳态具有决定性的意义. 耳蜗微血管内皮细胞在形态及结构上具有其特殊性:①具有大量的紧密连接;②大部分毛细血管内皮细胞为连续的无窗型内皮;③胞质内胞饮小泡少. 以上几点提示耳蜗微血管内皮细胞对于物质的通透具有选择性,维持