双向电泳原理及实验步骤.ppt

双向电泳原理及实验步骤
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7cm
10~100  g /125  l
200~500ug/125  l
11cm
50~200  g /185  l
250~1000ug/185  l
17cm
100~300  g/300  l
1~3mg/300  l
蛋白质样品的上样量
Enhanced Resolution for Detection of Low Abundance Proteins
等电聚焦中pH梯度的选择
先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。
ReadyStrip IPG Strip pH Ranges
3 4 5 6 7 8 9 10
Non-linear
-
-
-
-
Broad Range Separations
Tools to separate an entire sample on a single gel
pH 3-10
Complete linear view
pH 3-10NL
Improved separation of crowded pH 4-8 zone
pH 3-10
pH 3-10NL
More Data with Narrow Range IEF
pH 3-10
pH 3- 6
pH 5- 8
pH 7-10
IPG Effective
Strip pH Overlapping
Length Range Gel Area
24 cm 3-10 56 cm
18 cm 3-10 44 cm
17 cm 3-10 40 cm
11 cm 3-10 26 cm
7 cm 3-10 16 cm
聚焦时间的优化
要获得高质量的图谱以及很好的试验重复性，所需的最佳时间即为等电聚焦达到稳定态所需的时间。
聚焦最佳时间由不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。
聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。
过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。
IEF的基本条件
Stemp 1
Stemp 2
Stemp 3
total
voltage
Time
Volt-Hours
Ramp
250
20min
－－－
Linear
4000
4000
2hr
－－－
－－－
10,000V-hr
Linear
Rapid
5 hr
14,000V-hr
7 cm
Stemp 1
Stemp 2
Stemp 3
total
total
Stemp 1
Stemp 2
Stemp 3
11 cm
17 cm
250
250
8000
10000
10000
8000
20min
20min


－－－
－－－
－－－
－－－
－－－
－－－
20,000V-hr
40,000V-hr
～30,000V-hr
～50,000V-hr
hr
7 hr
Linear
Linear
Linear
Linear
Rapid
Rapid
两维间的平衡
等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电泳，也可于－80°保存数月。
但在第二向电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS-PAGE电泳能顺利进行。
建议方案：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mM Tris（）缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰***取代DTT后的上述缓冲液平衡15min。如果用TBP代替DTT则只需一步平衡。
二维SDS-PAGE
同普通SDS-PAGE类似。
但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰***胶）充当了浓缩胶。
Second Dimension SDS-PAGE
Mult