吉西他滨对人非小细胞肺癌A549细胞增殖与凋亡的影响.doc

吉西他滨对人非小细胞肺癌A549细胞增殖与凋亡的影响.doc吉西他滨对人非小细胞肺癌A549细胞增殖与凋亡的影响
【摘要】目的研究吉西他滨体外对人非小细胞肺癌A549细胞增殖及凋亡的作用。方法应用 MTT法,流式细胞仪,Annexin VPI双标法, Tunel法等多项方法,体外研究吉西他滨对A549细胞的促凋亡作用;采用免疫组化的方法,观察药物作用后bcl2表达的变化。结果吉西他滨对A549细胞生长具有抑制作用,并有促凋亡效应,对细胞周期的影响表现为S期的阻滞,药物处理的细胞凋亡,可见伴有bcl2的下调。结论吉西他滨可抑制人非小细胞肺癌A549细胞的生长,并诱导细胞发生凋亡,其诱导凋亡是吉西他滨抗肿瘤作用机制的原因之一,而且凋亡与bcl2的表达有一定关系。
【关键词】吉西他滨细胞凋亡非小细胞肺癌 bcl2
0 引言

非小细胞肺癌的预后比较差,尽管现在的治疗不断发展,生存率提高的还是很少[1]。凋亡受阻是肿瘤发生的主要原因,诱导肿瘤细胞分化和凋亡已成为当前肿瘤治疗的热点。吉西他滨(gemcitabine, 2′,2′difluoro2′deoxycytidine, dFdC)是一种新型的脱氧胞苷类似物和核苷还原酶抑制剂,对多种实体瘤具有良好的抗肿瘤活性[2]。但是体外研究其对非小细胞肺癌的凋亡作用及其凋亡机制的研究尚且不多。
1 材料和方法
药物与试剂

吉西他滨(健择,生产厂家:LILLY FRANCE ,注册证号:H20020180),RPMI1640培养基,小牛血清为Gibico公司产品,bcl2单克隆抗体购于北京晶美公司,HEPES,四氮唑蓝(MTT)、二***亚砜(DMSO),碘化丙啶(PI),免疫组化试剂盒,AnnexinVPI双标凋亡试剂盒均为北京中山生物公司产品。
细胞培养

人肺腺癌细胞A549由同济医院呼吸内科重点实验室冻存。细胞用含10%小牛血清的RPMI1640培养液在5% CO2, 37℃,饱和湿度的细胞培养箱培养, 细胞呈贴壁生长,%% EDTA(1∶1)消化传代,用于实验的细胞均处于指数生长期。
细胞体外生长活性的检测(MTT法)

取指数生长期的培养细胞,%胰蛋白酶消化,以1×104/孔的密度接种于96孔板,每孔设3个复孔,以不含细胞的培养液做空白对照。贴壁后,加入不同浓度的吉西他滨,按常规方法操作后,用酶联免疫仪测490nm处的吸光度(A490)值。
流式细胞仪分析细胞周期

各组药物处理细胞72h后,进行细胞消化,收集所有悬浮细胞。调整细胞密度为5×105 ~1×106个/ml,取1ml细胞,1 000r/min离心5min,去培养基。细胞收集后,加入70%乙醇置于-20℃冰箱固定过夜,PBS洗两遍。依次加入50μg/ml碘化丙啶(propidium iodide,PI)和1mg/mlRNase A,室温避光染色30min后上机检测。
AnnexinVPI双标记法分析细胞凋亡率

如上法收集药物处理72h后的细胞,按试剂盒操作说明书操作后,上流式细胞仪检测。采用CELIQUEST软件分析早期细胞凋亡率。
TUNEL法

制作不同浓度不同时间作用后的细胞爬片,按试剂盒操作说