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基因工程第八章
第1页，共49页，2022年，5月20日，12点7分，星期二
一、粘性末端的连接
DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。
第一节 DN***段的体外连接
1. 两段DNA的连接
依靠CC
CCGG-OH
-GGCCCTAG5’
5’GATCCCGG-OH3’
HO-GGCC5’
缺口
缺口
HO-
-OH
CIP处理
T4 ligase
虽然有缺口，但仍然能与DN***断连接。
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三、PCR产物的连接
1. 在引物的5’端设计酶切位点
符合载体的多克隆位点；
（1）设计原则
（2）带酶切位点的引物的结构
3’端15~20bp与模板互补；
5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。
（5’端多余的3~5bp属保护碱基）
避免与所扩增的DN***断内部酶切位点重复。
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引物1
GCAGAATTC
互补序列
模板
EcoRI位点
5’-
-3’
GCAGAATTC
互补序列
5’-
-3’
3’
模板
GCAGAATTC
互补序列 PCR产物
5’-
-3’
3’
复性
延伸
模板
模板
3’
3’
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GCTAGCCGG
互补序列
模板
BamH I 位点
-5’
3-’
5’
复性
延伸
模板
模板
3’
3’
GCTAGCCGG
互补序列
-5’
3’-
模板
5’
GCTAGCCGG
PCR产物 互补序列
-5’
3’-
引物2
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带酶切位点的PCR产物
GCAGAATTC
PCR产物
5’-
-3’
GCTAGCCGG
PCR产物
-5’
3’-
CGTCTTAAG
CGATCGGCC
EcoRI位点
BamHI位点
AATTC
PCR产物
5’-
-3’
GCTAG
PCR产物
-5’
3’-
G
C
EcoRI
BamHI
两头各有一个粘性末端！
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2. 与T载体直接连接
（1）PCR产物两个3’端一般都有一个A
Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。
（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T
利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！
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A
A
dNTP
T
T
dTTP
Taq DNA聚合酶
载体
PCR产物
TA
TA
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四、DNA体外连接应注意的事项
插入片断与载体的酶切位点互补
相同的粘性末端才能有效地连接。
尽量避免平端连接。
决不能进行非粘性末端连接。
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EcoRI
EcoRI
EcoRI
（1）用相同的酶切
（2）用同尾酶切
BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII
都产生GATC4个碱基的粘性末端。
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2. DNA插入的方向正确
（1）用双酶切
由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。
EcoRI
BamHI
EcoRI
BamHI
EcoRI
BamHI
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3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确
（1）DNA定向插入
（2）起始密码
尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。
ATGGAATTC
载体
ATGCGGAATTCT
插入片断
EcoRI
EcoRI
ATGGAATTC T
重组
但移码突变！
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4. 防止载体自身环化连接
（1）提高插入片断的用量
连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。
（2）用碱性磷酸酶处理载体
载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。
5’
3’
载体