分子生物学实验.docx

实验五:植物糖基转移酶的RNA提取及扩增
实验思路:
铁筷子(Helleborus Thibetanus Franch.) 是毛茛科(Ranunculaceae) 铁筷子属(Helleborus)多年生草本植物。其根茎呈结常状圆柱形,稍扁,~ cm,~ mm,较粗的通常有分枝,分枝顶端有茎痕和浅褐色干燥的小芽苞,表面黑褐色或灰黑色,常有数个类圆形窝状茎痕,环纹在结节的膨大处较密,质略硬,折断面不平坦灰白色,常有裂隙,维管束点呈环状排列,髓约占横切面直径的1/2。根茎上生有多数圆柱形细根,粗细较均匀,直径 - mm,表面黑褐色,有细纵皱纹和少数侧根及侧根痕,质脆,易折断,断面灰白色,显粉性。早春2月开花,花大,单生或2朵捧成单歧聚伞花序;萼片5,花瓣状,白色至粉红色;花瓣小,呈管状,不明显;雄蕊多数,心皮2~3分离。4月结果,蓇葖果。5月种子成熟,呈黑色。主要生长在秦岭山区南北坡海拔1100~3100 m的山地疏林或灌丛中。
铁筷子全属约有20余种,主要分布在欧洲东南部和亚洲西部。其中的Helleborus Thibetanus ,又名黑毛七、小桃儿七、小山桃儿七、九百棒、嚏根草等,是陕西民间一种疗效确切的草药。其性凉味苦,有小毒,具清热解毒、活血散瘀、消肿止痛之功效,主治膀胱炎、尿道炎、疮疖肿毒及跌打损伤等症。此外,铁筷子花色美丽,亦可作为早春观赏花卉。
实验材料
主要试剂及材料
公司
用途
数量/价格
铁筷子
液氮
氨苄青霉素
手术刀片
主要实验步骤:
样品采集
植物材料为五年大苗的铁筷子,实验取样时选择植物根茎,约1 g,立即使用液氮冷冻,-80 °C冰箱保存、备用。
实验材料准备:
%的DEPC水(通风橱中配置):用量筒量取去离子水1 L,在通风橱中加入1 mL DEPC到1 L去离子水中,%的DEPC。迅速盖上盖子,混匀,然后放在37 °C摇床中中速摇荡至少4 h。
%的DEPC水处理PCR管( mL)、EP管( mL)、研钵、镊子。浸泡过夜,次日倾倒DEPC水。将PCR管、EP管灭菌,研钵、药勺、镊子用锡箔纸包裹180 °C烘箱,2小时。
RNA提取
准备工作(试剂配置和器材准备)
实验所用的研臼、杵、小药勺、试剂瓶、量筒、%的DEPC水中浸泡24
h,用锡纸包裹于180 °C(烘箱)高温灭菌2 h或160 °C高温灭菌4 h后备用;塑料制品如进口枪头、Eppendorf管( mL, mL)高压灭菌,烘干后备用(放置时间不宜超过一周)。
RNase-free water的制备如下:%体积的DEPC原液(如1000 mL蒸馏水中加1 mL DEPC原液), 用塑料膜封口后,充分混匀,静置过夜,高压灭菌。(注意:DEPC有强诱癌作用,操作时须谨慎,加了DEPC的水放通风橱中,避免吸入气体)
操作前注意:RNase不易失活,在常规的高压灭菌中无法使其失去活力,且空气中、人的手上及唾液中都含有丰富的RNase,所以在分离RNA时应该采取有效的措施,抑制和避免RNase的污染;% DEPC(即焦碳酸二乙酯)% DEPC处理过的水配置,37 °C过夜,高压灭菌20 min。
避免外源RNase污染:
仪器:RNase free耗材、高温或DEPC处理器皿。
试剂:RNA实验专用、DEPC处理。
人员:戴口罩、手套。
环境:RNase free工作区。
避免内源RNase污染
操作快速。
液氮研磨/液氮速冻。
RNA保存试剂。
实验操作步骤
以下实验采用Trizol试剂法,此方法是异硫***酸胍法的改进,可从103个细胞或毫克级的组织中有效提取RNA,如果操作得当,获得的RNA会比较完整而未降解,且不含蛋白和DNA的污染。
,在液氮中研磨成粉末,。
注意:动作尽量迅速,避免RNA降解;另外,要尽量地选用幼嫩的植物材料,因其RNA的含量相对于老材料要丰富。
加入Trizol(比例:1ml Trizol/100 mg植物材料),用枪头反复抽吸混匀,之后剧烈震荡混匀,室温放置5
min。(混合液呈棕红色,可分成三大层:上层水相中含有RNA,中层含蛋白和下层有机相为材料残渣及DNA等)
注意:样品的量不要超过Trizol体积的10%,过多反而会降低RNA的得率。
(此步可根据实际情况选择做还是不做)当样品中蛋白、脂肪及多糖含量较高时,离心(4 °C,12,000 g,10 min),小心将上