番茄中果胶酶活力的测定.docx

实验三 番茄中果胶酶活力的测定
一、 实验原理
番茄中的果胶酶系相当复杂，它主要包括聚半乳糖醛酸酶（PG）和果胶酯 酶（PE）两类。聚半乳糖醛酸酶能催化果胶降解，导致果胶溶液粘度下降。因 此，可通过测定酶催化反应体系粘度下降的速度来测定实验三 番茄中果胶酶活力的测定
一、 实验原理
番茄中的果胶酶系相当复杂，它主要包括聚半乳糖醛酸酶（PG）和果胶酯 酶（PE）两类。聚半乳糖醛酸酶能催化果胶降解，导致果胶溶液粘度下降。因 此，可通过测定酶催化反应体系粘度下降的速度来测定它的活力，果胶酯酶能催 化果胶分子中半乳糖醛酸单位上的酯键水解，产生游离的羧基和甲醇，导致果胶 溶液的pH下降，因此可以用pH—stat法测定它的活力。
二、 试剂和仪器
试剂：20%***化钠溶液、- （I）、1%果胶 、- （II）、1mol/L***化钠溶液、 （准确标定）、
仪器：组织捣碎机、抽滤装置、水浴锅、秒表、常规玻璃仪器、奥氏粘度计、pH 计
三、 实验步骤
1、酶液的制备
300g番茄+ 100mL20%***化钠溶液
I
匀浆
I 离心（4°C,10000rpm，20min）
I I
沉淀 上层清液
I抽滤，量取清液体积
I I
沉淀 酶液I
I按516g硫酸铵/L酶液（80%的硫酸铵饱和度）
缓慢加入研细的硫酸铵粉末
I 离心（40C,10000rpm，20min）
I I
上层清液 沉淀
-醋酸钠缓冲液I
酶液II
（MWCO12000）
透析物
1离心（40°C,10000rpm, 20min）
I I
沉淀部分纯化的果胶酶溶液
2、 PG活力的测定
测定30C下水的流动时间，。
将50mL 1%果胶溶液（ ）、-醋酸钠缓冲液和30mL 去离子水置于250mL具塞三角瓶中并充分混和。将三角瓶置于30C恒温水浴中 保温。待温度达到平衡后，测定该混和液的流动时间，计为果胶空白。
移取上述混合溶液20mL到50mL三角瓶中，加入1mL已在同一温度下恒 温的酶液，立即混合，开始记录时间。移取10mL反应混和物到已恒温的奥氏粘 度计中，在不同的时间间隔连续测定混合体系的流动时间。以流动时间对测定时 间作图，并外推求出零点。从直线的斜率计算流动时间降低的速度，以每秒钟流 动时间降低的百分数表示果胶酶的活力。
3、 PE活力的测定
测定果胶酯酶的装置如图所示。在反应器中加入10mL 1%果胶溶液， 1 mol/L***化钠溶液和10mL去离子水，将恒温水浴温度调节到30C，采用 ，，开始计时。不 NaOH溶液，±，记录不同反应时间 下碱液的累积消耗量。每分钟释放出一个微克当量的羟基定义为1个果胶酯酶活 力单位。这里所说的“微克当量的羟基”实际上就是“氢氧根的微克数”。
作NaOH消耗量