常用分子标记技术原理及应用.ppt

常用分子标记原理与应用
整理课件
知识框架
生化标记
分子标记
细胞学标记
形态学标记
遗传标记
RFLP
RAPD
AFLP
SSR
ISSR
SNP
常见分子标记
整理课件
心的分子标记，包括RFLP、DNA指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记；
第二类：是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等，为第二代分子标记；
第三类：是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。
分子标记的分类
整理课件
英文缩写
英文名称
中文名称
RFLP
Restriction fragment Iength
polymorphism
限制性片段长度多态性
STS
Sequence tagged site
序列标签位点
RAPD
Random amplified polymor-
phic DNA
随机扩增多态性DNA
AFLP
Amplified frangment length
Polymorphism
扩增片断长度多态性
SSR
Simple sequence repeat
简单序列重复
SNP
Simple mucleotide polymor-
phism
单核苷酸多态性
几种主要的ＤＮＡ分子标记
整理课件


( )

( )

二、几种常见分子标记的原理及方法
整理课件
AFLP—扩增片段长度多态性标记( Amplified Fragment Length Polymorphism )
起源：1992年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。
定义:由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCR扩增而检测。AFLP是在RFLP的基础上发展起来的，差别在于检测手段。
核心技术：AFLP的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物组合。
整理课件
AFLP的原理Principle of AFLP
基本原理：对基因组DNA用两种限制性内切酶进行消化，连上相应的双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，并在3’端添加1-2个随机碱基对酶切连接后的DNA进行选择性扩增。此后再进行第二次PCR扩增，所用的引物是在第一次PCR中使用的选择性引物的3’端又附加了1-3个随机碱基。扩增产物用聚丙烯酰***凝胶检测，银染显色。
多态性源自限制性酶切位点的变异。
整理课件
AFLP的实验操作Procedures for AFLP
AFLP技术主要包括模板DNA制备、引物设计、酶切片段扩增及凝胶电泳分析4个步骤。各步骤具体的过程有：（EcoRI/MseI），完成AFLP的选择性扩增。 ***变性胶上电泳。，特异片段回收克隆分析。
整理课件
基
本
步
骤
AFLP
DNA提取
两种限制性内切酶酶切DNA
寡聚核苷酸接头的连接
对限制性酶切片段的选择性扩增
扩增产物的电泳分析
整理课件
AFLP技术路线
：通常用一个四个碱基识别位点的限制性内切酶如MseI和一个六个碱基识别位点的酶如EcoRI，其中MseI确保产生合适大小的DN***段，这些片段能在序列胶上进行有效的分离；而六碱基识别位点酶EcoRI能够限制扩增片段数目，确保DNA多态性的正常检测；
：接头序列包括：一个核心序列和酶切位点特异序列，MSE接头和ECORI接头，核心序列是一段已知的20核甘酸的DNA序列；
整理课件
：应用一对引物对酶切片段进行第一轮扩增，目的是富聚目标片段，减少本底，扩增引物序列为接头序列加一个选择核甘酸。只有一端为EcoRI切点，一端为MseI切点的DNA酶切片段，同时也与选择核甘酸配对的DNA序列才能被扩增。1～3步的产物可以通过Agarose胶检测。
：应用含有接头序列和三个选择核甘酸序列的引物进行选择扩增。通过这一轮扩增，进一步降低扩增片段数量，同时一个引物被同位素或荧光染料标记（也可用银染），电泳后压片检测。
整理课件
AFLP的原理