第五章固相析出分离法.ppt

第五章固相析出分离法
目的：
浓缩；
初步纯化 ；
将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。
固相析出法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。
概述
固相析出分离法：生化物质目的物经通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在40%-60%之间。
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
盐析方法：
1）分步盐析法(不同的盐浓度)
2）重复盐析法
高蛋白质浓度下共沉淀→重复盐析提高纯度
3）反抽提法(相同盐浓度)
2、盐析方法和注意事项
分级盐析法
不断提高盐浓度：不同蛋白质分级沉淀
低饱和度：除杂蛋白，高饱和度：沉淀目的物
血清
球蛋白
清蛋白
(NH4)2SO4
50%饱和度
饱和
析出
析出
单酶盐析曲线
双酶盐析曲线
反抽提法
共沉淀→较低浓度盐溶液溶杂蛋白
大肠杆菌RNA聚合酶的制备
防止“局部过浓”：慢加，搅拌
温度：不宜过低，室温10~25⁰C，易失活：0~10⁰C
时间：沉淀需经一段老化时间（1小时）后分离
注意事项：
第二节 有机溶剂沉淀法
一、基本原理
二、影响沉淀效果的因素
概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。
有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。
优点：
1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；
2）溶剂易除去
3）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；
缺点：
1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，
2）操作要求在低温下进行。
3）成本高，需防火防爆
总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。
一、基本原理
1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。
2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。
脱水作用比静电作用强
一些溶剂的介电常数
*
二、影响沉淀效果的因素

能与水无限混溶
介电常数小、沉淀强
变性小
毒性小，挥发性适中
常用：乙醇、***（挥发肝毒性着火点低）和甲醇（口服毒性）
介电常数：无水乙醇24，甲醇33，***22
乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；
***：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；
用量：（了解）

Pl附近、稳定性
控制溶液pH时务必使溶液中大多数蛋白质分子带有相同电荷，勿使目的物与杂质带异电荷导致共沉淀。
严格控制低温
有机溶剂与水混合时产生放热反应
预冷（有机溶剂-10℃以下，蛋白质0℃左右），
在冰盐浴中进行，
加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓变性，并散热。
温度影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。

低浓度缓冲液（-），<5%
少量的中性盐：保护作用，减少蛋白质变性，稳定介质pH，减少水和溶剂互溶现象
盐浓度较高（>）：盐溶，增大蛋白质在有机溶剂―水溶液中的溶解度，会增加溶媒用量，沉淀物中可能夹带盐，需除盐
常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、***化钠等。


Zn、Cu等与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，而活性不变，有助于沉淀，降低有机溶剂用量。
胰岛素精制：

较稀：溶剂量↑，收率↓，稀释变性
较高：共沉淀↑，分辨率↓，溶剂量↓，回收率↑，变性小
蛋白质初浓度：%~2%
粘多糖：1~2%
举例：固体发酵生产α-淀粉酶的提取工艺研究 α-淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水 过滤 水抽提清液  加乙醇（70%）搅拌 α-淀粉酶↓
* pH影响
收率% 酶活
收率
酶活
pH
* 适宜的pH ~
* 温度影响