柯萨奇病毒A组16型TaqMan一步法荧光定量RT-PCR快速检测方法的建立.pdf

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: 龙玲,袁正,尹龙萍,
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陈跃,. 陆敏玉,唐萌,夏婷,等.,纳米颗粒对人肝癌细胞游离
武汉理工大学学报,,:—. ,,:—.
,,. 收稿日期:一—编辑:罗劲娜
柯萨奇病毒组型一步法荧光定量
—快速检测方法的建立术
蔡丽娟,陈瑶,杜红延,陈骊嘉,李明
南方医科大学生物技术学院广州
【摘要】目的建立一种快速、灵敏、特异和准确的一步法荧光定量—方法用于检测柯萨奇病毒
组型,。方法根据登录的基因序列,应用生物学软件进行同
源性序列比对后,选出高度保守且特异的核苷酸区域基因,设计特异性引物和探针;
构建重组质粒作为阳性标准品,建立检测的荧光定量—方法,并对该方法的特异性、敏感
性、重复性进行评价。结果成功建立了的—检测方法和定量标准曲线,该方法最低检测限为
个拷贝/ ,与常规相比,敏感性提高倍。组内和组间重复性实验的变异系数小于%。该检测方法
特异性强,与肠道病毒型、柯萨奇病毒组型、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒型、登革热病毒、霍乱弧茵、
霍乱弧菌、大肠杆茵均不发生交叉反应。结论本实验建立的荧光定量—检测方法
灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于感染的日常检测和实验室早期快速诊断。
【关键词】柯萨奇病组型;探针;一步法荧光定量—;检测
柯萨奇病毒组型,. 荧光定量—反应试剂和核酸抽提试剂盒均由
属于小病毒科肠道病毒属成员,和肠道病毒中山大学达安基因股份有限公司提供。
型是引起儿童手足病最主要的种病原体。.. 毒株、菌株、临床标本来源、肠道病毒
由于某些地区手足口病的致病病毒发生变异, 型,柯萨奇病毒组型,肠道病毒型,脊髓灰质
和肠道病毒型常呈交替感染或共同流行,导致近年炎病毒、Ⅱ、Ⅲ型,登革热病毒,霍乱弧菌,霍乱弧
来引起的手足口病有增多趋势。传统上检测病菌,大肠杆菌均由福建省疾病预防控制中
毒的方法有病毒分离、血清学诊断和—等,这些心提供。
方法不仅操作复杂,费时费力,灵敏性不高,而且易产生. 方法
非特异性结果,不能在早期快速得出结论。近年发展.. 引物和探针设计从上下载不同年
起来的实时荧光定量—,因其操作简便快份和地区的基因序列,用生物学软件进行同源
速,灵敏度高,特异性强,重复性好,在病原体的定性定性比较,在保守区设计特异性引物和
量检测方面得到了广泛应用。年月至年探针,序列见表。引物和探针由上海博亚公
月,本研究通过建立一套的一步法荧司合成,探针端标记的荧光报告基团是,端标
光定量—快速检测技术,为流行病学调查和实记的荧光淬灭基团是。扩增长度为。
验室快速诊断提供了有效的分子检测手段。表引物和探针序列
材料与方法项目序列
. 材料上游引物一一
.. 主要仪器及试剂荧光定量仪下游引物一一
为公司产品;反应试剂、一步法荧光探针一——一
.. 阳性标准品的构建委托宝生物工程大连有
国家科技重大专项课题资助项目编号:—限公司构建重组质粒及测序。将构建好的重组质粒经
△通信作者。—:. 紫外分光光度