总氮量的测定-微量凯氏定氮法.doc

实验四微量凯氏定氮法
实验类型:综合项目学时:5
目的
1. 掌握微量凯氏定氮法测定样品总氮量和蛋白质的原理和方法
2. 学会使用凯氏定氮仪
原理
凯氏(Kjeldahl)定氮法常用于测定天然有机物(如蛋白质,核酸及氮基酸等)的含氮量。
天然含氮有机物与浓硫酸共热时,其中的碳、氢被分别氧化成CO2和H2O,而氮则变成氨,并进一步与硫酸作用生成硫酸铵,是为“消化”。
该反应进行得比较缓慢,通常需要加入硫酸钾/硫酸钠以提高反应的沸点,并加入硫酸铜作为催化剂促进反应的进行。以甘氨酸为例,其消化过程可表示如下:
NH2
浓碱可使消化液中的硫酸铵分解,游离出氨,借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量及一定浓度的硼酸溶液中,硼酸吸收氨后,氨与溶液中的氢离子结合,生成铵离子,使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定,直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止,最后根据所用标准酸的当量数(相当于待测物中氨的当量数)计算出待测物中的氮量。
滴定时用甲烯蓝和***红混合指示剂,其指示范围为pH ~,将NH4H2BO3的蓝/绿色滴至原来H3BO3的蓝紫色即为终点。
~ mg氮,相对误差应小于2 %。
试剂与器具
试剂
1. 浓硫酸(化学纯)
2. 30 %氢氧化钠(分析纯)溶液
3. %NaCl溶液
4. 硫酸钾-硫酸铜混合物:硫酸钾与硫酸铜以3:1 (W/W)配比混合研磨成粉末
5. 2 %硼酸
6. 混合指示剂(田氏): %甲烯蓝乙醇溶液50 %***红乙醇溶液200 ml混合配成(贮于棕色瓶备用,这种指示剂酸性时为紫色,碱性时为绿色,变色范围窄且灵敏)
7. M HCl
8. 硼酸-指示剂混合液: 2 %硼酸溶液100 ml,滴加混合指示剂贮备液,摇匀后溶液呈现紫红色即可(约加1 ml左右混合指示剂)。
9. 标准硫酸铵溶液( mg N/ml)
10. 卵清蛋白等含蛋白质样品
器具
凯氏烧瓶消化架吸量管(1 ml, 2 ml) 量筒(10 ml)
凯氏定氮蒸馏装置容量瓶(50 ml)
微量滴定管(3 ml, 5 ml, ml) 锥形瓶(50~100 ml)
操作步骤
㈠样品的处理
血清样品:取人血(或猪血)放于离心管中,于冰箱中放置过夜,次日离心除去凝血块,上层黄色透明清液即为血清。 %NaCl ml,仔细混匀备用。
固体样品:在称量瓶中称入一定量的磨碎的样品,置105 ℃(非游离的水不能在100 ℃以下烘干)烘箱内干燥4 h至恒重。
㈡消化
取2个50 ml凯氏烧瓶,向1号烧瓶内加2 g干燥样品(直接加至烧瓶底部,切勿沾于瓶口或瓶颈上),向2号烧瓶加入2 ml水作空白对照。
在每个烧瓶内加入硫酸钾- g,浓硫酸3 ml,小瓷片两粒,摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上,每个瓶口放一小漏斗,在通风厨内的电炉上消化。
在消化开始时,应控制火力,不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完,硫酸开始分解并放出SO2白烟后,适当加强火力,继续消化,直至消化液呈透明蓝绿色为止。
消化完毕,待烧瓶内容物冷却后,加蒸馏水10 ml (注意慢加,边