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印迹技术(blotting)
印迹(blotting)是指将凝胶中的待测核酸等样品用类似于吸墨迹的方法转移到固相膜上,转移之后待测样品在固相膜上的相对位置保持不变。
探针(probe):广义上讲,探针是指能与特定靶分子发生特异性相互作用,并能被特殊方法所检测的分子。
如:抗原-抗体,生物素-亲合素,受体-配体等。
印迹技术分类
DNA blotting:Southern blotting
RNA blotting:Northern blotting
Western blotting:immunoblotting
一、定义
Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。是一种检测蛋白质表达水平的方法。
二、原理
Western Blot采用的是聚丙烯酰***凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如***纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot一般流程
蛋白样品的制备
SDS聚丙烯酰***
凝胶电泳
转膜
封闭
一抗杂交
二抗杂交
底物显色
三、过程
1、提取蛋白质
RIPA裂解液
() 50 mM
Nacl 150 mM
NP-40 1%
脱氧胆酸钠 %
SDS %
EDTA 1 mM
PMSF 1 mM
Na3VO4 1 mM
现用现加
(提取总蛋白,主要是
胞浆蛋白的裂解液)
其中的NaCl和Tris base是构成提取液的主要成分,起到缓冲液的作用,缓冲液可以对抗蛋白质溶液PH值的改变,因此对于保持蛋白质的稳定以及保证实验重复性十分重要。 EDTA为金属离子鳌合剂,由于细胞内许多酶的活性需要金属离子的存在,因此加入鳌合剂后可以抑制蛋白酶的活性,也就可以防止蛋白被分解。 而脱氧胆酸钠和SDS都是属于阴离子型去垢剂。使用这些去垢剂的作用是可以将蛋白质以单体的形式分离。 NP-40属于非离子型去垢剂,与离子型去垢剂相比,其对蛋白之间的相互作用干扰较弱,但是对于分离功能性的蛋白复合物较为适用。PMSF:苯***磺酰***,Na3VO4是 Na -K+ ATP酶的抑制剂 两者都是蛋白酶抑制剂。
2、蛋白定量:测定溶液中蛋白质浓度。
(1)凯氏定氮
(2)测定OD280:可测定芳香族氨基酸(酪氨酸和色氨酸)的含量,但易受组成和杂质的影响。
(3)考马斯亮蓝G250染色:侧链集团与G250显色, 根据深浅测定蛋白质含量。
(4)福林-酚试剂法(Lowry)
蛋白质的酪氨酸、色氨酸半胱氨酸的残基+Cu2+
OH-
紫色化合物
紫色化合物还原磷钼酸、磷钨酸
蓝色化合物
比色测定
分光光度计
原理:
在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合,形成蛋白质-铜复合物。(双缩脲反应 Biuret Reaction)
蛋白质-铜复合物使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原,生成钼蓝-钨蓝蓝色化合物,蓝色深浅与蛋白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线,测定样品中蛋白质含量。(还原反应)
常用改良的Lowry法:
1 2 3 4 5 6 sample 1 sample 2 sample 3
1 2 4 8 16 32 10 10 10 (µl)
BSA
(1 mg/ml)
999 998 996 992 984 968 990 990 990 (µl)
NS
浓度
(µg/µl)
1 2 4 8 16 32
+ A液 ml
50℃,10 min
+ B液 ml
室温,10 min
+ C液 3 ml
50℃,10 min
平衡到室温,650 nm测吸光度值
(2 g酒石酸钾钠+100 gNacl溶于500 ml 1 MNaOH中,再定容至1000 ml)
( 2 g酒石酸钾钠+1 g ,先溶于少量水中,再定容至90 ml,再加入10 ml 1 MNaOH)
(市售的酚试剂,1:15稀释)
改良的Lowry法:
根据标准品绘制标准曲线
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