角膜缘干细胞体外培养的研究进展.doc

角膜缘干细胞体外培养的研究进展.doc角膜缘干细胞体外培养的研究进展
【关键词】角膜缘;干细胞;体外培养;眼损伤
角膜上皮细胞具有自我更新的能力,眼表的正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成。随着眼表疾病研究有突破性进展,角膜缘干细胞在眼表中的重要性越来越受到人们的重视,角膜缘干细胞体外培养的研究也日渐增多。笔者现就角膜缘干细胞的体外培养与临床应用作一综述。
1 概述

角膜缘干细胞是角膜上皮增殖、分化、移行的源泉。角膜缘干细胞具有其他干细胞所具有的特殊的生物学特性,并通过向心性移动和角膜上皮基底细胞的分裂、迁移,来补充角膜表面脱落的上皮细胞,完成上皮细胞的更新这一动态的平衡过程。目前认为角膜缘Vogt栅栏内的网状嵴上皮是角膜上皮干细胞的位置所在。1971年Davanger等[1]提出角膜缘Vogt栅栏的概念并观察到此处细胞向角膜中心水平移动。1986年Schermer等[2]利用特异性64KD角蛋白(K3)的手段,正确定位角膜缘上皮干细胞的存在。1987年Ebato等[3]通过比较角膜不同部位细胞在体外培养的生长情况,也进一步证实角膜上皮干细胞位于角膜缘处。

角膜缘干细胞的确定和经过不断的探索研究,发现角膜缘干细胞具有以下特点[4]:①位于角膜缘基底部,%~10%;②具有水平向心运动和垂直向上运动;③增殖力高,细胞周期长,分化程度低,不对称分裂;④不表达角蛋白K3;⑤含有丰富的蛋白酶:α-烯醇酶、细胞色素氧化酶、碳酸酐酶等;⑥角膜缘上皮细胞正常处于G1晚期,细胞富含周期蛋白A、D、E和增殖细胞核心抗原。
2 角膜缘干细胞的获取和分离
角膜缘干细胞的正确定位,使获得干细胞作体外培养成为可能。
取材
动物取材在全身麻醉下进行,用1/1000络合碘消毒眼周,冲洗眼球后用手术刀从角膜缘切取组织块。尸体取材时,在死亡后6h内取下眼球,剪取角膜缘内外各1mm角膜缘组织,去除多余结膜组织和基质层。用含双抗(105u/L青霉素加100mg/L链霉素)Hank液漂洗备用。
角膜缘干细胞的分离和培养
常用的分离方法有组织块直接培养、消化法及两种方法同时应用的混合法。
组织块培养法
将上述组织块剪成1mm×1mm×1mm大小,放入含少量纯胎牛血清培养瓶中密闭2h,缓慢加入少量培养基,37℃,5%CO2,95%湿度孵化箱过夜,次日补加培养基。接种后3天首次换液,以后隔日换液,每日倒置显微镜观察。此法操作环节少,细胞损伤小,可减少污染机会。但培养时间长,细胞成分复杂,常混有纤维细胞,分离和纯化较困难。
酶消化法
将组织块剪成2mm×2mm大小,Hank液冲洗2次,/L EDTA 1∶1混合为消化液,用量为组织量的30~50倍,消化10~15min到组织块疏松,弃去消化液。Hank液冲洗2次,消除EDTA消化作用,加入等量200ml/L胎牛血清的细胞培养液终止胰蛋白酶消化。吸出培养液后再加入新的培养液2次,消除残余消化作用。然后加入培养液进行吹打使细胞分散,1000r/,离心5min,取重悬细胞以100×106/L接种量移入有孔培养板进行培养。此法可在较短时间内获得细胞进行培养和研究,但操作复杂,对消化时间和温度的控制有