课程设计思路.ppt

该【课程设计思路 】是由【baba】上传分享，文档一共【23】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【课程设计思路 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。蛋白质工程


活力和构象的比较研究
开放
设计实验
突变:易错PCR
pETBlue-2
纯化:Ni2+螯合层析
荧光光谱仪
双光束紫外分光光度计
α-淀粉酶的固定化及活性测定
酶工程
碱性磷酸酶的定点突变
反应体系
ddH2OXuL

10xbufferMg2+Free5uL
引物(10umol/L)2uL/each
模板DNA1uL
Ex-()
Mg2+(mM)2,3,4,5,6,7
Mn2+(mM)0,,,,
(94℃,1’—55℃,1’—72℃,2’)30个循环,72℃,10’
%琼脂糖凝胶
1xTAE
PCR产物的回收(博大PCR产物快速胶回收试剂盒)
、称胶重,每100mg胶加入700uL溶胶液,550C溶胶(确定要完全溶解)。
,12000rpm离心30秒,去除废液。
:500uL漂洗液,12000rpm,30秒漂洗一次,去除废液,重复漂洗一次。
,2分钟,。
,放置5分钟。
,30秒。
,放置5分钟。
,2分钟。

质粒DNA的提取
接含pETBlue-2(质粒的单菌落于4mLLB羧苄(50ug/mL)和四环素()液体培育基中

370C,190rpm振荡培育过夜

4000rpm、离心1min,收集全部菌体

150uL溶液I悬浮菌体(旋涡混匀),室温10min

加入200uL溶液II(轻轻混匀!),室温静置菌液裂解变清

加入200uL溶液III(轻轻混匀!),冰上静置15min质粒DNA复性

12000rpm,离心10min

上清加等体积的酚:***仿:异戊醇(旋涡混匀)

12000rpm,离心5min

上清加等体积的***仿:异戊醇(旋涡混匀)

12000rpm,离心5min

上清加2倍体积的无水乙醇(旋涡混匀),室温30min

12000rpm,离心10min

沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次(振荡混匀、离心)

12000rpm,离心5min

沉淀于超净台中风干

沉淀加入20uLRTE,600C水浴30分钟溶解

-200C保存
370C酶解3小时
酶切产物的纯化和回收(博大PCR产物快速胶回收试剂盒)
每100uL溶液加入700uL溶胶液,其余的操作步骤同前。
向柱子的正中心加20uL洗脱buffer,其余的操作步骤同前。
酶切和连接
限制载体和目的基因的比例为1:3-10
140C连接过夜
-200C保存,用于转化受体细胞