D1蛋白酶的克隆表达、纯化、生物活性测定及抗体的制备初探.pdf

华中师范大学
硕士学位论文
D1蛋白酶的克隆表达、纯化、生物活性测定及抗体的制备
姓名:李慧
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:祁超;李伟国
20100501
摘要靶标的新型除草剂,需要对先导化合物的生物活性进行检测和筛选。由于该蛋白在天然蛋白中的含量较低,所能提取得到的酶蛋白总量也有限,因此采用基因工程的的基因,分别连接至表达载体蚿中,并在大肠杆菌进行高效表达。。以合成的前体蛋白羧基端肽作为模拟底物,采用高效液相色谱倍。采用纯化后的蛋白免疫日本长耳大白兔制备了多克隆抗体、免疫/雌鼠制各了单克隆抗体,ú舛ǘ哐G蹇固宓男Ъ劬叽:到甑タ寺】固逑赴辍K媒峁R种萍料鹊蓟衔锏纳秆『兔傅鞍子牖衔的作用机理研究提供了必要的基础。关键词:蛋白酶;表达;纯化;活性测定;抗体鞍酌,怯梢堵烫搴薱虮码,主要用于酶切蛋白前体羧基端延伸的肽段,使蛋白前体转变为成熟的蛋白,从而用于光合系统中锰簇合物的组装,具有维持光合系统损伤一修复循环过程的重要作用,该酶切过程是植物进行光合作用必不可少的步骤。因此,蛋白酶被认为是一个新型优异的广谱除草剂作用靶标。为了开发以蛋白酶作为方法可获得稳定来源的酶蛋白,以供大规模的筛选所需。本文通过基因工程方法,选用大肠杆菌原核表达系统表达菠菜蛋白。从菠菜中提取总孀B己铣蒭捎镁酆厦噶词椒从扩增了,嬗盏寂养小时条件下,重组质粒在,盏寂嘌小时条件下,重组蛋白均可获得高效表达。分别采用亲和层析法对重组蛋白进行了纯化,甈蚖法测定了其水解活性,结果表明活性可达/N南妆ǖ朗莸驳畉/
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⑨储戳:张作裕盔缓糊戳:Ⅷ氇作者签名:孝交妖.∞扎华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明各洲学位论文版权使用授权书\原创性声明定享受相关权益。回童途塞握銮卮澄厦┳坏┒坏┤卟本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师指导下,独立进行研究工作集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同意华中师范大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。允许北京万方数据电子出版社出版的《中国学位论文全文数据库》将本人论文本人已经认真阅读“咝Q宦畚娜氖菘夥⒉颊鲁獭保饨ū救说学位论文提交“咝Q宦畚娜氖菘狻敝腥姆⒉迹⒖砂础罢鲁獭敝械墓争日所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权以电子、网络、镜像及其他数字媒体形式公开出版。签师期硕士学位论文一.’●●●【。
⑨第一章综述除草剂的重要性蛋白和蛋白酶到亿,预计到年,将会达到亿。随着人口数量的增加,必然会对农业在寻求产量增长的方式中,利用除草剂消灭有害生物,提高作物产量是一种行之有充分认识到农药在提高作物产量方面具有很重要的作用3菁磷魑E┮┑钠分之一,在农药市场中占有很重要的地位。根据其作用机理可将目前市场上广泛使用的除草剂分为以下啵采婕暗鲎饔冒斜辏抑制植物必需氨基酸的合影响叶绿体功能来实现其除草的目的【。光能的高效吸收、传递和转换是光合作用的核心问题之一,而这一过程主要由存在于光合膜上的光系统春咸謇赐瓿伞负责催化水的裂解和质体醌的还原,位于类囊体膜上,是一个多亚基蛋白复合体,主要集中于垛叠的基粒膜区,利用光能分解水,释放氧,质子和电子【。目前对于的结构已经有了色细菌反应中心结构的研究成就中得到了启示,有力地推动了Ⅱ反应中心的研究进展,例如年的法国谑旃使夂献饔么蠡嵘希鱿至撕芏这方面的论文引,年拢谟⒐鶪召开的第十四届国际光合作用大是国际光合作用研究中最为活跃的领域之一。农药对于保证农业实现稳产增收具有重要意义。据统计,年世界人口已达生产提出更高的要求,这一问题在发展中国家则更为突出。由于我国人口众多,耕地有限,而且今后二三十年,随着人口逐渐增加、耕地逐渐减少,粮食产量不足的矛盾也会日益突出。要解决这些问题,只能依靠提高单位耕地面积上的粮食产量【¨。效的方法。据报道,通过农药的使用,我们国家每年可挽回粮食万吨、蔬菜水果万吨、棉花蚨帧8莘⒋锕业某晒橐约拔夜┝忠档氖导嗣且丫成;种乒夂献饔玫慕蹋抑制类脂的合成;种埔端岬淖饔茫抑制植物色素的合成:种葡赴姆⒂破坏膜的完整性;扇偶に的平衡9嗄曛蟹⑾值某菁链蠖嗍峭ü,