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2022年4月LABORATORYANIMALSCIENCEApril2022
§论著§
miR-208b干预对心肌梗死小鼠的保护作用
诸培佳I俞洁霏I耶亦华2顾晔'张江蓉“
(::海200336)()()
(,I:海200092)
摘要:目的研究miR-208b对心肌梗死(myocardialinfarction,Ml)小鼠的保护作用方法构建心肌梗死小鼠模
型,将造模成功的小鼠随机分为模型组(MI组)"空载体组(Ad组,注射未携带miR-208bantagomir腺病毒)、实验组
(miR-208bantagomir组,注射携带miR-208bantagomir腺病毒),另选取未进行前降支结扎的小鼠作为假手术组
(Sham组)使用超声心动检测心功能指标,利用qRT-PCR测定小鼠心肌miR-2O8b的表达,通过TTC染色测定小
鼠心肌梗死面积,-2和
Bax的表达水平,结果小鼠心肌梗死7d后,与Sham组比较,MI组及Ad组小鼠心肌梗死周围区域miR-2081>的
表达显著上调(P<),miR-208bantagomir组小鼠miR-208b的表达显著较MI组下调(P<);miR-208b
antagomir组心肌梗死面积明显小于Ml组(P<);、miR-208bantagomir组小鼠左心室舒张末期内径
(LVEDd)、左心室收缩末期内径()水平明显髙fSham组,而左室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(FS)显著降
低(P<);miR-208bantagomir组小鼠I.\EDd和LVESD水平明显低于MI组,而LVEF和FS显著升高(P<);
MI组、Ad组及miR-208bantagomir组心肌细胞的凋亡率明显髙于Sham组(P<),miR-208bantagomir组小鼠心
肌细胞的凋亡率明显低于M[组(P<);Westernblot实验结果显示,MI组与Ad组心肌梗死小鼠心脏组织中
Bcl-2明显下调(P<),Bax的表达明显较Sham组上调(P<),miR-208bantagomir组Bel-2的表达明显较MI
组上调(P<),Bax的表达明显较MI组下调(P<)<结论miR-2O8b在心肌梗死小鼠心肌组织中高表达
抑制miR-,进而发挥心脏
保护作用,
关键词:miR-208b;心肌梗死;小鼠;保护作用
中图分类号:Q95-3;:A文章编号:1006-6179(2022)02-0044-06
DOI:.1006-
急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,护作用
是致死率较高的心血管疾病,近年来其发病率
AMI)1材料和方法
逐渐年轻化并呈上升趋势"。冠状动脉粥样硬化

造成的心肌血管堵塞以及斑块破裂是心肌梗死的主
:雄性C57BL/6J小鼠,10周龄,
要原因心肌梗死造成心脏局部缺血缺氧,导致心
体质量25-35g,购自北京维通利华实验动物技术
肌细胞凋亡,进而产生心室重构,减弱患者的心功
有限公司,实验动物生产许可证号:【SCXKf京)
能,最后逐渐发展为心力衰竭,是威胁人类生命健康
2016-0011]按照海申德医院医学伦理委员会的相
的主要疾病之一"miR-208主要在心脏表达,与
关规定进行实验,伦理委员会审批号:[SCXK(沪)
心脏损伤有关,大量研究发现3miK-208b在急性2017-0005]
心肌梗死患者中呈高表达,:miR-208bantagomir腺病毒及空
因此,本研究使用miR-208bantagomir转染心肌梗载腺病毒购自上海汉恒生物公司;TTC和TUNEL试
死小鼠,观察miR-208b干预对心肌梗死后小鼠的保剂盒购自Roche;PowerSYBRgreenPCRmastermix、
收稿日期:2021-01-10
作者简介:诸培佳(1982—).女,硕士,主治医师,研究方向:心血管病、老年病学•E-mail:zpj_******@
通信作者:张江蓉(1971—),女,硕士,副主任医师,研究方向:-mail:******@
第2期诸培佳等:miR-2O8l>I-预对心肌梗死小鼠的保护作用•45•
TaqManUniversalPCRMix、7VzgManmicroRNAAssay于心肌梗死周围区域注射等量的携带miR-208b腺
均购自宝生物工程(大连)有限公司;Bcl-2及Bax病毒溶液,(4xlO7TU)。
单克隆抗体购自SantaCruz,0-:术后,精心饲养
上海研谨生物科技有限公司;RIPA裂解液购自北京1周后各组随机选取6只小鼠将其麻醉,采用超声
索莱宝科技有限公司;BCA试剂盒购自Thermo心动图检测左心室舒张末期内径(LVEDd)、左心室
Fbher公司:SDS-PAGE凝胶、电泳液等购自中科瑞收缩末期内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)、短
泰(北京)生物科技有限公司。轴缩短率(FS)等心功能指标。
:CM1520冷冻切片机购自Leica;-PCR:qRT-PCR检测心肌梗死小鼠心
荧光定量PCR仪购自ABI;逆转录试剂购自肌组织中miR-208b的表达。各组随机选取6只小
Pmmega;液氮罐购自四川乐山东亚机电工贸有限公鼠,将小鼠心脏组织进行胰蛋白酶消化,离心后提取
司;电泳仪及转膜仪/稳压电源购自Bio-rad;离心机总RNA,经逆转录为cDNA,使用TaqMan探针和
购自Heraeus;紫外分光光度计、酶标仪和超低温冰miR-208b特异性引物进行实时荧光定量PCR反
箱购自Thermo;成像系统购自Pierce;小动物呼吸机应。定量PCR反应条件:95tJOmin,95°C、15s,
购自HarvardApparatus。40个循环,62t、1min,40个循环。以U6作为内
,用2亠"方法分析数据。miR-208b引物序
:参考Li等°:和史列,F:5'-TCCACACAGAGGGGACTCTT-3',R:5'-
建伟"建立心肌梗死小鼠模型。小鼠仰卧位固定TGAGCATGAAGGCATAGCAC-3';U6弓|物序歹ij,F:
于手术台,手术区域消毒,使用50mg/kg***和5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',R:5'-AACGCTTCAC
5mg/kg***进行腹腔注射麻醉,行气管插管并GAATTTGCGT-3'。
连接呼吸机。麻醉后沿胸骨左侧4~5肋间切皮,:TTC染色法测定小鼠心肌梗
钝性分离皮下组织与肌肉,打开胸腔,用胸骨撑开死面积。手术后精心饲养1周后,各组随机选取
器固定肋骨,充分暴露心脏,分离心包膜,使用7/06只小鼠,处死取出心脏,用PBS溶液冲洗用纱布
滑线结扎左心耳下缘2~3mm处的冠状动脉前降吸干心脏表面水分,置于-20T冰箱中冷冻
支,结扎处缺血区的左心室前壁逐渐变为灰白色,20min后切片,进行TTC染色,37七避光孵育
,说明心肌梗15min,5min晃动容器一次,染色后PBS溶液冲
死小鼠造模成功。在成功构建心肌梗死小鼠的心洗,拍照。图中灰白色区域为心肌梗死区,砖红色
肌梗死周围区域(心肌颜色灰白区周边)
(0、3、6、9点及中央),分别用微量注射器注射面积心肌梗死%=100%x(梗死面积/心脏切面
%生理盐水、腺病毒载体溶液及携带miR-208b总面积)。
腺病毒溶液各25pL后,清除胸腔积血,:荧光TUNEL法测定心肌
伤口,逐层缝合胸壁,并抽取胸腔负压,待小鼠自梗死小鼠心肌梗死周围区域心肌细胞的凋亡。各
,将小鼠心梗周围组织切片
严格按照无菌操作进行,并将小鼠置于SPF环境进行石蜡包埋,按照TUNEL试剂盒操作步骤进行
下繁殖饲养(温度25七、相对湿度55%)1周。为脱蜡及水合,,
,封片。经荧光染
霉素。色后凋亡的细胞在荧光显微镜下呈现绿色,正常
:将造模成功的小鼠随机分为模型细胞为蓝色,
组(MI组)、空载体组(Ad组)、miR-208bantagomir值。凋亡率%=100%x凋亡细胞数/(凋亡细胞数
组(实验组)。所有处理均同造模组,但是未进行前+正常细胞数)。
降支结扎小鼠作为假手术组(Sham组)。:Westernblot检测心肌梗死小
组小鼠在MI模型构建成功后于心肌梗死周围区域鼠心脏组织中Bel-2及Bax的蛋白表达。各组随机
%生理盐水,Ad组小鼠于心肌梗死选取6只小鼠,将小鼠心肌梗死周围组织裂解后,提
周围区域注射等量的腺病毒载体溶液,-PAGE凝胶电泳,
・46・实验动物科学39卷
转膜后,
,孵育1h后漂洗,加入
ECL发光试剂,曝光后拍照,使用ImageJ软件进行
分析

,数据采川
均值士标准差(乂±$)表示,组间比较采用单因素方差
分析,组间两两比较使用LSD-t检验,P<
异有统计学意义:
图1心肌梗死小鼠心肌组织中miR-208b的表达
2结果
注:与Sham组比较.*P<;与MI组比较,#P<
--208binmyocardialtissueof
micewithmyocardialinfarction
小鼠心肌梗死7d后,与Sham组比较,MI组和
Note:Comparedwiththeshamgroup,*P<;
Ad组小鼠心肌梗死周围区域miR-208b的表达显著
ComparedwiththeMIgroup,#P<
上调(P<),说明niiR-2081)在心肌组织中增加;
各组小鼠心肌梗死7d后,MI组、Ad组和实验组小
实验组小鼠miR-208b的表达显著较Ml组下调
鼠心肌梗死面积分别为(±)%、
(P<),说明携带miR-208bantagomir的腺病毒
(±)%、(+)%,实验组心
已成功转染至心肌梗死小鼠的心肌组织(图1)。
肌梗死面积明显小于MI组、A<1组(P<),说明
-208b干预对心肌梗死小鼠心肌梗死面积
心肌梗死小鼠miR-208b的表达明显上调,miR-208b
的影响
干预可减轻心肌梗死的影响(图#2)/
••
••
••
图2miR-208b干预对心肌梗死小鼠心肌梗死面积的影响
注:LjSham组比较,*/><;与MI组比较,#P<
-208hinterventiononmyocardialinfarctionareainmicewithmyocardialinfarction
Note:ComparedwithIheshamgroup,*P<;#P<
-208b干预对心肌梗死小鼠心功能的影响表1各组小鼠超声心动图检测结果
与Sham组比较,MI组、Ad组及实验组小鼠Table1Echocardiographicresultsofmice
ineachgroup(x±s=6)
,LVEF和FS%显著
组别LVED(l/mmLVESD/mmLVEF/%FS/%
降低(P<);与MI组比较,±±±±
与LVESD水平明显降低,LVEF和FS%显著升高M【±**±±*±3.*19
±*±*±*±'
(P<),MI组和Ad组小鼠LVEDd与LVESD水
±*#±*"4&25±*#±,#
平和LVEF和FS%比较差异无统计学意义注:与Sham组比较."<;与Ml组比较,#P<
(P<)(表1)。Note;Comparedwiththeshamgroup,*P<;ComparedwiththeMl
group,#P<
第2期诸培佳等:miR-208b干预对心肌梗死小鼠的保护作用•47•
-208b干预对心肌梗死小鼠心肌细胞凋亡的率明显高于Sham组(P<),实验组小鼠心肌细
影响胞的凋亡率明显小于MI组(P<),MI组和Ad
Sham组、MI组、Ad组和实验组小鼠心肌细胞组小鼠心肌细胞的凋亡率比较无统计学意义
的凋亡率分另I]为(±)%,(P>)。以上说明心肌梗死小鼠心肌细胞的凋
(±)%+)%和(,miR-208b干预可抑制心肌梗死小鼠心
)%:MI组、Ad组和实验组心肌细胞的凋亡肌细胞的凋亡(图3)
Ad组实
Sham组MI组
%
、去
DAPI0
旧展哥率虽
TUNEL
J
ciJN
f
u
MERGE
图3心肌梗死小鼠心肌梗死周围区域心肌细胞的凋亡
注:与Sham组比较,*P<;与MI组比较,#P<

Note:Comparedwiththeshamgroup,*P<;ComparedwiththeMIgroup.#P<
-208b干预对心肌梗死小鼠心肌组织心肌梗死小鼠心脏组织中Bax的表达明显较Sham
Bcl-2和Bax表达的影响组上调,实验组Bax的表达明显较MI组及Ad组下
Westernblot实验结果显示,4组小鼠心脏组织调(P<);MI组及Ad组小鼠Bcl-2和Bax的表
中Bcl-2及Bax的表达差异显著(P<),MI组和达无显著差异(P>)。说明心肌梗死小鼠Bcl-2
Ad组心肌梗死小鼠心脏组织中Bcl-2的表达明显明显下调,Bax的表达明显上调,由此可知miR-208b
较Sham组下调(P<),实验组Bcl-2的表达明干预能明显上调心肌梗死小鼠心脏Bcl-2的表达,
显较MI组及Ad组上调(P<);MI组和Ad组下调Bax的表达(图4)。
口Sham组
曾艮來友吳口
2=地验a
BCI-
Ad实组
g
BaW
IX

P-actin
图4miR-208b干预对心肌梗死小鼠心肌组织Bcl-2和Bax表达的影响
注:与Sham组比较,*P<;与MI组比较,#P<
-208binterventionontheexpressionofBcl-2andBax
inmyocardialtissueofmicewithmyocardialinfarction
Note:Comparedwiththeshamgroup,*P<;ComparedwiththeMIgroup,#P<
肌梗死后而受到损伤并凋亡,丧失其原有的功能,进
3讨论而引起心室重构,梗死部位胶原及纤维增生形成瘢
痕组织,降低心肌的收缩性,出现心脏失代偿性扩
心肌细胞是不可再生的,局部心肌细胞会因心大,心功能减弱,进而导致心力衰竭,严重影响患者
・48・实验动物科学39卷
的生活质量随着近年来基因治疗的崛起,众多细胞会出现凋亡,引起心室重构:本研究结果显示,
相关研究表明miRNA能改善心肌梗死后大鼠的心实验组小鼠心肌细胞的凋亡率明显小于MI组;实
功能9101O验组Bel-2的表达明显较MI组上调,Bax的表达明
microRNA(miRNA),提示miR-208b可能是通过调控
通过与靶基因mRNA3,UTR特异性结合而抑制靶Bel-2及Bax的表达影响心肌细胞的凋亡,延缓心室
基因mRNA表达或使其降解,从而调控基因的表重构,进而改善心肌梗死小鼠的心功能,实现其心肌
达,进而参与细胞的增殖与凋亡:,,-|210刘鹏飞等保护作用。
使用携带miRNA-486的腺病毒转染心肌梗死后大因此,AMI小鼠心肌梗死周边区域miR-208b的
鼠的心肌梗死区,发现可降低心肌梗死面积,改善大表达明显升高,通过干预AMI小鼠心肌miR-2081)
鼠心功能:miRNA-2081)属于miRNA-208家族,由的表达可明显改善其心功能,可能与其减弱心肌细
Myh7基因编码,在心肌及骨骼肌组织中特异性表胞凋亡有关,具体机制还有待进一步研究。
达,与心脏发育及心肌损伤等生理及病理相关:李
建民等"研究发现,AMI患者miR-208b水平明显参考文献
升高,其早期诊断效能优于心肌肌钙蛋白(eTnI)
和肌酸激酶同工酶(CK-MB),通过检测miR-208b[1:,-IIDAC5-
水平可冇助于AMI的早期诊断及治疗“另冇研VEGF通路促进心肌梗死大鼠血管新生"「中国病理生理
杂志,2018,34(4):643-649.
究表明,>mR-208b在组织损伤时可快速释放入血,
[2MaJ,LiZY,LiangXP,e/-
并在心肌组织中特异性高表达;急性心肌梗死时,
myocardialinfarctionventricularremodelingandmyocardial
miR-208b表达升高,可作为AM1诊断和预后的敏感fibrosisinratsbyregulatingTGF-p/Smadssignalingpathway
生物标志物15161□Alavi-Moghaddam等"研究显[,2017,14(5):301-307.
示,AMI组miR-208b的表达明显高于健康对照组;[3Eriksson0M,CalaisF,RosenbladA,
且miR-208b表达升高与AM1患者的长期生存期降ofsulxlinicalormanifestextracoronanarterydiseasesafteracute
,2017,263:53-59.
低有关但是,目前miR-208b对心肌梗死后心肌凋
I4MostafaAM,MohammadC,AlipoorSD,
亡的相关研究较少,所以本研究使用携带miR--2081)afteracutemyocardialinfarction:
的腺病毒转染心肌梗死小鼠,研究其通过调控心肌impacton6-monthsurvival[)2Markers,:1-8.
细胞的凋亡对心脏的保护作用,[5HaI)ZJ,,LingY,
本研究中使用结扎前降支的方法,重现AMI的microRNA-208levelinacutemyocardialinfarctionpatientsand

发病过程:在构建AMI模型的过程中发现5只小
(20):307.
鼠死亡,小鼠心肌梗死模型构建的成功率为
[6],OkadaH,TakemuraG,
%,又选取同一批次10只小鼠进行AMI模型withadenoviralvectorexpressingdecorinmitigatescardiac
构建并成功后,使用腺病毒转染心肌梗死小鼠:7<1remodelinganddysfunction[­
后发现,与Sham组比较,MI组及Ad组小鼠心肌梗Physiol,2009,297(4):H1504.
死周围区域miR-208b的表达显著下调,实验组小鼠[[J].中西
医结合心血管病电子杂志,2018,6(27):71-73.
miR-2081)的表达显著较MI组上调,说明miR-208b
[8:张苗苗,韩冰,庞慧,等•急性心肌梗死后心脏结构和神经
在心肌梗死小鼠中表达下调,且腺病毒已成功转染
重构的实验研究[•!]•,
心肌梗死小鼠并在其心肌组织中表达:本研究结果31(4):338-342.
还显示,实验组心肌梗死面积明显小于Ml组;MI[9]王珏,黄伟聪,郑亮承,-24对心肌梗死后心肌
组、Ad组、实验组小鼠LDH和CK水平明显大于细胞凋亡的调控作用[,
Sham组,实验组小鼠LDH和CK水平明显小于MI(4):590-596.
[10]凌琳,凌子成,-22改善小鼠心肌
组。以上结果提示,miR-208b干预可明显减少心肌
梗死后心功能]J•,26(5):
梗死面积,改善心功能:
457-462.
细胞凋亡是由基因控制的程序性死亡,心肌梗[11Sandiford0A,MooreCA,DuJ,
死后机体为了保持细胞所处环境的稳定,局部心肌cancer:
第2期诸培佳等:miR-208b干预对心肌梗死小鼠的保护作用・49・
MedBiol,2018,1056:-4378.
〔12]XinY,YangC,-499asapotential[15]刘灿章,谢莲娜,郎明非,
biomarkerforacutemyocardialinfarction[J].AnnTranslMed,段抬高型心肌梗死直接经皮冠状动脉介入治疗患者循环血
2016,4(7):-208b水平及术后心功能影响[J].中国循环
[13]刘鹏飞,张海涛,齐弘炜,-486对大鼠杂志,2018,33(10):984-988.
心肌梗死后心脏功能损伤的改善[J].中国医科大学学报,[16]LiuXX,YuanL,ChenF,-208b:A
(7):595-
[⑷李建民,叶军,王如珠,-208b在急性心肌梗死prognosisofacutemyocardialinfarction[,2017,63
患者的早期诊断价值[J].中国老年学杂志,2018,38(18):(1):101-109.
ProtectiveEffectofmiR-208bonMyocardialInfarctionMice
ZHUPeijia1,YUJiefei1,WUYihua2,GUYe3,ZHANGJiangrong4
(,ShanghaiShendeHospital,Shanghai200336,China)
(,ShanghaiInternationalMedicalCenter,Shanghai200120,China)
(,ShanghaiInternationalMedicalCenter,Shanghai200120,China)
(,XinhuaHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China)
Abstract:ObjectiveTostudytheprotectiveeffectofmiR-
(MI
group),theemptybodygroup(AdgroupwithoutmiR-208bantagomir),theexperimentalgroup(miR-208b
antagomirgroupwithmiR-208bantagomir).Themicewithoutligationofanteriordescendingbranchwereselected
astheshamoperationgroup(shamgroup).Echocardiographywasusedtodetectcardiacfunction,theexpression
ofmiR-208bwasmeasuredbyqRT-PCR,theareaofmyocardialinfarctionwasmeasuredbyTTCstaining,the
apoptosisofmyocardialcellsintheperipheryofinfarctionwasdetectedbyTUNEL,andtheexpressionofBcl-2and
BaxinmyocardialcellswasdetectedbyWestern-,the
expressionofmiR-208bintheMIgroupandtheAdgroupwassignificantlyincreasedcomparedwiththeSham
group(P<);TheinfarctareaofthemiR-208bantagomirgroupwas