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2022,49(7):2768-2777
China Animal Husbandry &Veterinary Medicine
火炭母缓解鼠伤寒沙门菌致小鼠肝
损伤的机制研究
沈幸玲,丁康宁,王幽丛,张易安,刘逸雷,刘涵笑,唐陆平,何永明
佛山科学技术学院生命科学与工程学院佛山
(,528225)
摘要目的探讨火炭母口服液对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏的保护作用及其机制方法将只雄性
:【】。【】48
小鼠随机分为组空白对照组模型组阳性药物组及火炭母高中低剂量组每组只阳性药物组小
BALB/c6:、、、、,8。
鼠灌胃庆大霉素火炭母高中低剂量组小鼠分别灌胃和火炭母空白对照组和模型组小
(20mg/kg),、、16、84g/kg,
鼠分别给予等体积的连续给药预防性给药后空白对照组小鼠灌胃其他组小鼠一次
PBS,8d。2d, PBS,
性灌胃鼠伤寒沙门菌溶液给药结束后处死小鼠解剖取肝脏制作组织切片并经染
5×104 CFU/mL。,,HE
色观察肝脏病理变化平板培养基培养肝脏组织悬液检测小鼠肝脏载菌量检测干扰素
,,Western blottingα(IFN-α)、
肿瘤坏死因子白介素结合激酶干扰素调节因子蛋
IFN-β、IFN-γ、α(TNF-α)、1β(IL-1β)、TANK1(TBK1)、3(IRF3)
白表达水平。【结果】肝脏病理观察结果显示,模型组小鼠肝脏有淤血,大量炎性细胞浸润,肝细胞明显肿胀、排列
紊乱,胞质染色加深,肝细胞坏死和凋亡;经火炭母处理后,高剂量组小鼠肝脏组织中少量炎症细胞,淤血及肝细胞
坏死和凋亡的情况得到改善,肝细胞染色深、轻微肿胀、排列紊乱,而中、低剂量组除肝细胞胞质染色深、轻微肿胀、
排列紊乱外其他病变不明显与空白对照组相比模型组小鼠肝脏中鼠伤寒沙门菌负荷显著增加
,。,(P<),
和表达显著下降和表达水平则显著上升
IRF3、P-IRF3、IFN-α、IFN-βIFN-γ(P<),TNF-αIL-1β(P<);
与模型组相比火炭母各剂量组小鼠肝脏中鼠伤寒沙门菌负荷均显著降低中剂量火炭母能明显增强
,(P<),
蛋白的磷酸化和蛋白的表达及其磷酸化水平增加的蛋白水平
TBK1IRF3(P<),IFN-α、IFN-β、IFN-γ(P<
且能显著降低和的分泌结论火炭母可能通过上调途径诱导
),TNF-αIL-1β(P<)。【】TBK1-IRF3IFN
产生缓解鼠伤寒沙门菌感染致小鼠肝损伤以给药剂量效果较好
,,8g/kg。
关键词火炭母鼠伤寒沙门菌肝损伤结合激酶干扰素调节因子
:;;;TANK1;3
中图分类号文献标识码
::A
开放科学资源服务标识码
Doi:.1671- ()(OSID):
Study on the Mechanism of Polygonum chinense Liver Injury
Induced by Salmonella Typhimurium in Mice
SHEN Xingling,DING Kangning,WANG Youcong,ZHANG Yian,LIU Yilei,
LIU Hanxiao,TANG Luping,HE Yongming
(School of Life Science and Engineering,Foshan University,Foshan528225,China)
Abstract:【Objective】This study was aimed to investigate the protective effects of Polygonum
chinense L.(,PCL)on the liver of mice infected with Salmonella Typhimurium(S.
Typhimurium)and its underlying mechanism.【Method】48male BALB/c mice were randomly
divided into 6groups:Normal,model,positive drug,PCL-H,PCL-M and PCL-L in
the positive drug group were given gentamicin(20mg/kg) in the PCL-H,PCL-M and
收稿日期
:2021-12-08
基金项目广东省科技计划项目广东省农业农村厅项目广东省教育厅项目
:(2015A040404048);(2019KJ119);(2017GCZX006)
联系方式沈幸玲丁康宁沈幸玲和丁康宁对本文具有同等贡献并列为第一作
:,E-mail:******@;,E-mail:******@。,
者通信作者唐陆平何永明
。,E-mail:******@;,E-mail:******@
期沈幸玲等火炭母缓解鼠伤寒沙门菌致小鼠肝损伤的机制研究
7:9672
PCL-L groups were orally administered with PCL at 16,8and 4g/kg, normal
and model groups mice were given with the same volume of drugs were administered for
8consecutive 2days of prophylactic administration,the mice in the normal group were
given PBS,and the mice in the other groups were given solution
(5×104 CFU/mL)at one the administration,the mice were killed,and the liver was
dissected to make tissue sections and stained with HE to observe the pathological changes of the
liver tissue suspension was cultured in the plate medium to detect the bacterial load in
the liver of the blotting was used to detect the expression levels interferon alpha
(IFN-α),interferon beta(IFN-β),interferon gamma(IFN-γ),tumor necrosis factorα(TNF-α),
interleukin 1β(IL-1β),TANK-binding kinase 1(TBK1)and interferon regulatory factor 3
(IRF3)protein.【Result】The pathological observation of liver showed that the liver of mice in
the model group had congestion and a large number of inflammatory cells
hepatocytes were obviously swollen and disordered,the cytoplasmic staining was deepened,and
the hepatocytes were necrotic and PCL-H mice,there were a few inflammatory cells
in liver,congestion and necrosis and apoptosis of liver cells were PCL-M and PCL-L,
except for hepatocytes with dark cytoplasmic staining,slight swelling,and disordered
arrangement,other lesions were not with the normal group,the load of S.
Typhimurium in liver of the model group mice was significantly increased(P<),and the
expressions of IRF3,P-IRF3,IFN-α,IFN-βand IFN-γwere significantly decreased(P<),the
expressions of TNF-αand IL-1βwere significantly increased(P<).Compared with the
model group,the load of in liver of mice in PCL-H,PCL-M and PCL-L groups
was significantly decreased(P<).Among them,PCL-M could significantly enhance the
phosphorylation of TBK1and IRF3proteins and the expression of IRF3protein(P<).The
protein levels of IFN-α,IFN-βand IFN-γwere significantly increased(P<),and the
secretions of TNF-αand IL-1βwere significantly decreased(P<).【Conclusion】PCL could
induce the production of interferon through enhancing TBK1-IRF3pathway to alleviate the liver
damage of mice infected by ,and the dosage of 8g/kg was better.
Key words:Polygonum chinense L.;Salmonella Typhimurium;liver damage;TBK1;IRF3
鼠伤寒沙门菌是和肝炎等疾病[]鉴于火炭母具有良好的抗菌消
(Salmonella Typhimurium)7。
一种食源性病原体,可经消化道、呼吸道等途径传炎功效,且对小鼠肝损伤具有一定的保护作用,本
[]研究拟建立鼠伤寒沙门菌感染小鼠模型探讨火
播1,主要侵害人和动物的肠道。其通过复杂的途,
[]炭母对其肝脏的保护作用及可能的机制以期开
径入侵宿主并进行复制2,易导致一系列病症,包括,
发一款中药制剂用于预防或治疗鼠伤寒沙门菌
胃肠炎、菌血症和局部感染,也会引起肝损伤,主要,
所致的肝损伤
表现为炎症细胞浸润、严重充血、肝细胞凋亡和肝脏。
氧化损伤变性和坏死等[]沙门菌的血清型众多
、3-4。
且菌株复杂因环境不同而产生差异菌株防控极其材料与方法
,,1
困难[5]中国中兽药资源丰富应用历史悠久且毒菌株及试验动物
。,,
副作用小安全有效在细菌和病毒感染疾病防治方鼠伤寒沙门菌菌株编号半数致死量
、,(:14028,
面取得了显著成绩[6]火炭母为4 由广东省微生物菌种保
。(Polygonum(LD50)5×10CFU/mL)
是一种蓼科植物主要分布于中藏中心提供只周龄体重的雄
chinense L.,PCL),。483~5,14~16g
国的西南地区含有多种多酚如槲皮素没食子性健康级小鼠由广东省医学实验动
,,、SPFBALB/c,
酸表儿茶素绿原酸等具有良好的抗氧化抗物中心提供合格证号所有动物
、、,、,:44007200083689。
菌、消炎、止泻作用,常用于治疗腹泻、肠炎、痢疾饲养于佛山科学技术学院动物室,室内温度控制在
中国畜牧兽医卷
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光暗循环提供啮齿动物标准饮防性给药后除空白对照组外其他组小鼠一次
(23±2)℃,12h/。2d,,
食小鼠自由饮水饮食所有动物工作均按照中华性灌胃4鼠伤寒沙门菌诱
,、。 5×10 CFU/mL
人民共和国科学技术部制定的实验动物护理和使导感染空白对照组灌胃等体积继续给药
《,PBS,6d,
用指南批准文号进行并经佛山科学采用***麻醉再颈椎脱臼处死所有小鼠解剖取肝
》(:2006—398),,
脏组织备用
技术学院实验动物伦理委员会批准。。
主要试剂肝脏组织病理检查

火炭母批号北京同仁堂中药有限取各组小鼠肝脏的相同部位,在多聚甲醛
(:190501,4%
公司庆大霉素公司亮绿琼脂培养基中固定,经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡
);(Sigma);24h
包埋进行切片厚度展片脱蜡后采
公司干扰素抗体抗,,3~5m,、,
(Solarbio);α(IFN-α)、IFN-βμ
用染色,梯度酒精脱水,中性树胶封片,光学
体、抗体、肿瘤坏死因子()抗体、白HE
IFN-γαTNF-α显微镜下镜检观察小鼠肝脏组织病理学特征及
介素抗体结合激酶抗,
1β(IL-1β)、TANK1(TBK1)
变化。
体、磷酸化结合激酶()抗体、干
TANK1P-TBK1鼠伤寒沙门菌细菌负荷测定

3(IRF3)、称取约肝脏组织于预冷的

3(P-IRF3)-3-中经组织破碎仪破碎进行倍梯度稀释吸取各
抗体公司,,10,
(GAPDH)(Cell Signaling Technology);浓度匀浆液至亮绿琼脂无菌培养板中每个
增强型化学发光试剂发光底液100μL,
ECL()(Bio-Rad梯度个重复置于培养箱中培养记录
3,37℃24h,
公司)。
培养基表面的单个菌落数,计算载菌量。
火炭母口服液制备与主要成分测定
分析小鼠肝脏蛋白表达量
Western blotting
1∶20,将细胞组织快速裂解液与
(RIPA Lysis Buffer)
,煎煮,收集药液,共煎煮次,合并药液,苯***磺酰***蛋白酶抑制剂混合
(PMSF)100∶1,
纱布过滤,蒸发浓缩至分别含生药、和用于提取小鼠肝脏的总蛋白经分离
;SDS-PAGE,
/的火炭母口服液,置于密封保存。低温下湿法转膜至膜上采用脱脂奶粉
℃PVDF,5%
利用高效液相色谱法检测火炭母主要室温封闭清洗膜将膜分
(HPLC)1h;TBSTPVDF;PVDF
化学成分。主要材料为,别与
Ecosil C18 ×250mmIFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IRF3、
色谱柱使用梯度程序液为磷酸水溶液一抗孵育过夜次日
,:%,BP-IRF3、TBK1、P-TBK14℃,
液为乙***内从液到液的线清洗次每次用辣根过氧化物酶
;50min15%A30%ATBST3,10min;
性梯度液持续以的标记的山羊抗兔二抗孵育
,15%A25min,(HRP)IgG37℃1h,
流速洗脱火炭母中的化合物在处检测柱清洗次每次发光底液进行
,260nm,TBST3,10min;ECL
温控制在进样量检测前色谱柱先用显色通过软件分析蛋白质的相对强度
40℃,20μL。,Image J。
流动相平衡所有检测样品进样前均先统计分析
10~30min,
经滤膜过滤试验数据使用软件进行单因素方
。SPSS
试验动物饲养与给药差分析试验结果均以平均值标准差表示
,±。P<
将只试验小鼠随机分为组空白对照组表示差异显著
486:。
模型组阳性药物组鼠伤寒沙
(NC)、(MOD)、(PC,
门菌庆大霉素火炭母高剂量组结果
+20mg/kg(GM))、2
鼠伤寒沙门菌火炭母火炭母中火炭母口服液主要成分及其含量测定结果
(PCL-H,+16g/kg)、
剂量组鼠伤寒沙门菌火炭母和火火炭母的指纹图见图。没食子酸(峰
(PCL-M,+8g/kg)HPLC1
炭母低剂量组鼠伤寒沙门菌火炭)、绿原酸(峰)和金丝桃苷(峰)是火炭母的主要
(PCL-L,+4/k123
gg化学成分试验中火炭母口服液的种指示成分质
母每组只给药体积为阳性药物,3
),8。2mL/100g,
量控制如下:没食子酸/,绿原酸
组灌胃给予庆大霉素溶液,火炭母高、中、低剂量组≥≥
金丝桃苷
,≥。
、
液模型组和空白对照组小鼠灌胃等体积的预
,PBS,
期沈幸玲等火炭母缓解鼠伤寒沙门菌致小鼠肝损伤的机制研究
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峰没食子酸峰绿原酸峰金丝桃苷
1,;2,;3,
Peak 1,Gallic acid;Peak 2,Chlorogenic acid;Peak 3,Hyperoside
图火炭母主要成分图谱
1 HPLC
HPLC of main components of PCL
火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏病理变火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏载菌量

化的影响的影响
空白对照组小鼠肝脏中肝小叶结构完整肝由图可知相对于空白对照组模型组小鼠肝
;3,,
细胞以中央静脉为中心放射状排列胞质染色不脏中鼠伤寒沙门菌负荷显著增加与模
,(P<)。
均匀染色可见大量空泡细胞核被染成蓝色型组小鼠相比阳性药物组和火炭母各剂量组小鼠
,HE,,,
呈不等数量分叶细胞膜染成红色细胞边界清肝脏中鼠伤寒沙门菌生长明显受到抑制
,,(P<
晰窦状隙中存在少量炎症细胞图模型组其中阳性药物组和火炭母中低剂量组小鼠
;(2A)。);、
小鼠肝脏中央静脉边界不清,血管通透性增加,大肝脏中未能检测到鼠伤寒沙门菌的菌落,而火炭母
量炎性细胞进入血管(以淋巴细胞和中性粒细胞高剂量组仍有鼠伤寒沙门菌附着,但比模型组小鼠
为主肝脏组织有红细胞渗出肝细胞排列紊乱肝脏的载菌量显著减少
),;,(P<)。
明显肿胀结构发生变化胞质染色加深空泡减火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏
,,, IRF3
少可见肝细胞坏死和凋亡边界不清晰肝窦炎及表达的影响
,,;TBK1
性细胞增多图阳性药物组小鼠肝脏组织中由图可知与空白对照组相比模型组小鼠肝
(2B)。4,,
炎症反应明显减少少量红细胞渗出肝细胞坏死脏中蛋白及其磷酸化蛋白的表达显
,,IRF3P-IRF3
的情况明显减轻肝细胞轻度肿胀排列紊乱图著降低与模型组小鼠相比阳性药物
,,((P<)。,
火炭母高剂量组小鼠肝脏组织中肝细胞肿组和火炭母各剂量组小鼠蛋白表达均显著上
2C)。IRF3
胀排列紊乱胞质染色深部分肝细胞坏死炎症升阳性药物组和火炭母高中剂量组
、、,,(P<);、
细胞浸润轻微淤血图火炭母中剂量组小小鼠肝脏中表达水平均显著上升
,(2D);P-IRF3(P<
鼠肝细胞轻微肿胀排列紊乱少量炎症细胞浸火炭母低剂量组表达水平显著低
、,),P-IRF3
润红细胞渗出肝细胞及凋亡的情况得到极大的于模型组
、、(P<)。
改善图火炭母低剂量组小鼠肝细胞轻微肿模型组小鼠肝脏中和蛋白表
(2E);TBK1P-TBK1
胀排列紊乱胞质染色深少量炎症细胞浸润未达水平显著高于空白对照组与模型组
、、,,(P<)。
见明显的淤血和肝细胞坏死图火炭母中对比阳性药物组的和蛋白表达水
(2F)。、,TBK1P-TBK1
低剂量组的恢复程度较高剂量组好与阳性药物平均显著下降而火炭母各剂量组小鼠
,(P<);
组差别不大肝脏中的表达量显著降低
。TBK1(P<),
表达量则显著上升
P-TBK1(P<)。
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空白对照组模型组阳性药物组火炭母高剂量组火炭母中剂量组火炭母低剂量组肝细胞肿胀
①A,;B,;C,;D,;E,;F,。②a,;
炎症细胞浸润血细胞渗出肝细胞坏死和凋亡
b,;c,;d,
①A,Normal control group;B,Model group;C,Positive drug group;D,PCL-H group;E,PCL-M group;F,PCL-L group.②a,
Swelling of hepatocytes;b,Inflammatory cell infiltration;c,Hematocrit exudation;d,Hepatocyte necrosis and apoptosis
图火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏病理变化的影响
2
Effects of PCL on liver pathological changes of mice infected with
火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏中干扰

素表达水平的影响
由图可知与空白对照组小鼠相比模型组小
5,,
鼠肝脏中和水平均显著下降
IFN-α、IFN-βIFN-γ
与模型组小鼠相比阳性药物组及火炭
(P<)。,
母高中剂量组小鼠肝脏中和表
、IFN-α、IFN-βIFN-γ
达水平均显著上升火炭母低剂量组则
(P<);
较模型组显著下降
(P<)。
火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏中
TNF-α
和蛋白表达的影响
IL-1β
由图可知与空白对照组相比模型组小鼠肝
6,,
肩标不同字母表示差异显著肩标相同字母表示脏中和蛋白水平均显著升高
(P<);TNF-αIL-1β(P<
差异不显著下同与模型组相比阳性药物组小鼠肝脏中
(P>)。)。,
和蛋白表达水平均显著降低
Values with different letter superscripts mean significantTNF-αIL-1β(P<
();火炭母各剂量组小鼠肝脏中表达量
differenceP< with the same );TNF-α
superscripts mean no significant difference(P>).The均显著降低火炭母中低剂量组小鼠
(P<);、
same as below水平表达显著降低而火炭母高剂
图火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏载菌量的影响IL-1β(P<),
3 量组中表达量显著升高
IL-1β(P<)。
Effects of PCL on liver bacterial loading of mice
infected with
期沈幸玲等火炭母缓解鼠伤寒沙门菌致小鼠肝损伤的机制研究
7:3772
图火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏和蛋白表达的影响
4 IRF3TBK1
Effects of PCL on the expression of IRF3and TBK1proteins in liver of mice infected with
图火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏干扰素表达的影响
5
Effects of PCL on the expression of IFN in liver of mice infected with
中国畜牧兽医卷
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图火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肝脏中和表达的影响
6 TNF-αIL-1β
Effects of PCL on the expression of TNF-αand IL-1βin liver of mice infected with
讨论死及凋亡载菌量结果显示模型组小鼠肝脏中鼠
3 。,
伤寒沙门菌负荷极高空白对照组阳性药物组火
中药化学成分是保肝药物的研究热点之一[8],,、、
炭母中低剂量组均未检测出菌落生长火炭母高剂
多糖、苷类、黄***、生物碱等可对肝脏进行有效保、,
护[]中药在抗微生物感染领域的研究较多如量组有少量鼠伤寒沙门菌以上结果提示火炭母
9-10。,。,
口服液对鼠伤寒沙门菌引起的小鼠肝损伤起到很好
中药黄连、大黄、柴胡等对金黄色葡萄球菌有较好的
的治疗效果其作用效果与火炭母的使用浓度有关
消除作用[11];而以金银花、连翘和黄芩配伍的双黄,,
其中高剂量的火炭母在改善肝损伤及抑制鼠伤寒沙
连可溶性粉的黄***组分可发挥抑菌作用[12]。若能
门菌生长方面不如中低剂量的火炭母效果好可能
合理使用中药,减少抗生素的使用频率,将有助于减、,
是此药物作用范围较窄超过最佳剂量后随着浓度
少耐药菌的产生。火炭母有酚酸类、甾体类、黄***,
升高药物作用效果反而下降了
类、挥发油等化学成分,可发挥抗炎止痛、抗氧化、抗。
机体的固有免疫系统通过模式识别受体
菌、抗病毒、抗腹泻等药理作用[13]。本实验室首次
识别病原体相关分子模式可经过
对广东产火炭母的主要化学成分没食子酸、绿原酸(PRR)(PAMP),
酚酸类和金丝桃苷黄***醇苷类同时进行含量测由结构域衔接蛋白联接的信号通路
()()IFN-βTIR
依赖性通路激活复合物进一步促
定,以保证药材品质。研究发现,没食子酸具有护(TRIF),TBK1,
进的活化与磷酸化[]当被磷酸化激
肝、抑菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、止血、保护心血管等IRF322。IRF3
多种生物活性[]绿原酸对多种细菌表现出明显活后易位到细胞核并启动的表达[23-24]
14-15;IFN-Ⅰ。
的抗菌活性[]且对肝脏疾病也有治疗作用[]是一类糖蛋白有广谱的抗病毒作用可激活免
16,17-18;IFN,,
疫细胞干扰病原体复制提高的产生可改善
金丝桃苷对酒精性肝炎和非酒精性脂肪肝疾病都有、,IFN
一定的疗效[]火炭母或许可通过这些化学成分鼠伤寒沙门菌引起的疾病[25-26]鼠伤寒沙门菌感
19-20,。
染通常能导致强烈的炎症反应伴随着炎症细胞因
抗微生物感染,对肝脏起保护作用。,
肝脏具有一定的免疫功能在炎症的发生维持子和趋化因子的分泌如和[27]促炎
,、,TNF-αIL-1β。
细胞因子的生物合成和分泌与动物肝损伤相关机
和消退方面具有重要作用[21]。本研究发现,鼠伤寒,
沙门菌感染后小鼠肝脏出现明显病变表现为肝脏体中和表达水平在一定程度上体现
,TNF-αIL-1β
组织淤血炎症明显肝细胞染色加深明显肿胀排了机体中炎症反应的强弱[28]等[29]研究结果表
,,、、。Li
列紊乱可见区域性的肝细胞坏死和凋亡从肝脏明***感染鼠伤寒沙门菌后空肠的
,。,,TBK1、IRF3、
病理切片的结果来看火炭母的抗炎效果虽不及庆含量均降低而