希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26的功能分析 段灵涛.pdf

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植物病理学报
ActaPhytopathologicaSinica
ISSN0412-0914,CN11-2184/Q
《植物病理学报》网络首发论文
题目:希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26的功能分析
作者:段灵涛,曾淼林,王莉,祝一鸣,何九卿,周而勋
DOI:.
收稿日期:2022-04-15
网络首发日期:2022-08-01
引用格式:段灵涛,曾淼林,王莉,祝一鸣,何九卿,
基因ChAtg26的功能分析[J/OL].植物病理学报.
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发论文视为正式出版。
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췸싧쫗랢쪱볤ꎺ2022-08-0113:53:14
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植物病理学报
ACTAPHYTOPATHOLOGICASINICA研究论文
doi:.
希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26的功能分析
##*
段灵涛,曾淼林,王莉,祝一鸣,何九卿,周而勋
(华南农业大学植物保护学院/广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室,广东广州510642)
摘要:希金斯炭疽菌(Colletotrichumhigginsianum)是一种重要的植物病原真菌,可引起严重的十字花科
蔬菜炭疽病,对蔬菜生产造成了很大的影响。为了探究希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26在致病过程中
的作用,本研究以希金斯炭疽菌侵染拟南芥Col-0后的cDNA为模板,通过qRT-PCR技术测定了ChAtg26
基因在侵染过程中的表达模式,并利用同源重组技术构建了ChAtg26基因的敲除与回补突变体,分析了敲
除ChAtg26基因对希金斯炭疽菌生长发育与致病能力的影响。结果表明,ChAtg26基因在病菌侵染寄主后
0~40h中有较高的表达量,而敲除ChAtg26基因后,病菌在生长速率、孢子萌发、附着胞形成以及对氧
化胁迫敏感性方面没有明显变化,但是会在菌落黑色素累积与对细胞壁胁迫的敏感性方面有所下降,同时
其产孢量与致病力会明显降低,说明ChAtg26基因参与了希金斯炭疽菌的黑色素合成、细胞壁胁迫应答反
应、产孢与致病过程,并在这些过程中起着重要作用。
关键词:希金斯炭疽菌;自噬相关基因ChAtg26;基因功能分析;致病力
FunctionalanalysisofautophagyrelatedgeneChAtg26inColletotrichumhigginsianum
##*
DUANLingtao,ZENGMiaolin,WANGLi,ZHUYiming,HEJiuqing,ZHOUErxun(GuangdongProvinceKey
LaboratoryofMicrobialSignalsandDiseaseControl,CollegeofPlantProtection,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou
510642,China)
Abstract:Colletotrichumhigginsianumisanimportantplantpathogenicfungusthatcancauseseverecruciferous
vegetableanthracnose,
autophagy-,thecDNAofArabidopsisthalianaCol-0
,andtheexpressionpatternofthegeneChAtg26
duringtheinfectionprocesswasdeterminedbyqRT-,thegene
knockoutandmutantcomplementationwereperformedthroughhomologousrecombinationtechnology,andthe
收稿日期:2022-04-15;修回日期:2022-04-29
基金项目:广东省自然科学基金项目(2021A1515011166);国家重点研发计划专项(2017YFD0200900)
通信作者:周而勋(1963-),男,博士,教授,博士生导师,研究方向:分子植物病理学;E-mail:******@
共同第一作者:段灵涛(1997-),男,博士生,研究方向:分子植物病理学;E-mail:******@
曾淼林(1996-),女,硕士生,研究方向:分子植物病理学;E-mail:******@。:.
段灵涛,等:希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26的功能分析2
effectsofthegenedeletiononthegrowth,
resultofexpressionpatternshowedthatthegeneChAtg26reachedthemaximumexpressionlevelafter40hof
,nosignificantlyeffectswereobservedonthemycelialgrowthrate,
conidiumgermination,appressoriumformation,andsensitivitytooxidativestress,butthemutantshowedthe
reductionofmelaninaccumulationinthecolony,thesensitivitytocellwallstress,andthesignificantlydecreased
,
inthemelaninsynthesis,cellwallstressresponse,conidiaproductionandpathogenesis.
Keywords:Colletotrichumhigginsianum;AutophagyrelatedgeneChAtg26;Functionalanalysisofgene;
Pathogenicity
中图分类号::A
炭疽菌(Colletotrichumspp.)是一类重要的植物病原真菌,曾在2012年被评为世界十大植物病原菌之
一[1]。希金斯炭疽菌(),又称希金斯刺盘孢,俗称十字花科植物炭疽菌,是一种重要的半
活体营养型植物病原真菌,能够侵染多种十字花科植物如芸薹属(Brassica)和萝卜属(Raphanus)蔬菜
以及模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)等,从而引起严重的十字花科植物炭疽病[2-4]。菜心(B.
parachinensis)是一种以花薹为产品的十字花科、芸薹属蔬菜,并且是华南地区重要的特色蔬菜之一。由
希金斯炭疽菌引起的菜心炭疽病是菜心生产上的重要病害之一,而华南地区高温高湿的环境条件十分有利
于该病害的发生。菜心炭疽病不仅会影响菜心的品质和质量,还会造成菜心的减产,在发病严重时损失甚
至达到30%~40%[5-6]。目前,对于菜心炭疽病的防治主要还是化学防治与选育优良抗病品种为核心,仍缺
乏十分有效的防治措施[7]。由于希金斯炭疽菌易于进行培养和基因操作,且其基因组与转录组测序数据已
公布,因此,利用希金斯炭疽菌—拟南芥互作体系来研究炭疽菌的致病机理,为高效新型杀菌剂的研发提
供新靶标,对十字花科蔬菜炭疽病新型防控措施的制定具有十分重要的理论意义和应用价值[8-9]。
自噬是真核生物细胞中一种十分保守的主要降解途径,对病原真菌的生长发育与致病过程中具有十分
重要的影响。因此,研究自噬相关基因在病原菌侵染植物过程中的作用,将有助于在生产中有效地防控相
关的植物病害[10]。自噬会通过形成自噬小体来包裹待降解的物质如受损的细胞器、蛋白质等进入溶酶体或
者液泡内进行物质的降解与回收,从而保证细胞能够维持饥饿条件下的营养循环、发育或凋亡期间胞内物
质与结构的重塑以及处置不需要的或者受损的细胞器等功能[11-12]。通过对底物的选择性,自噬可分为选择
性自噬和非选择性自噬[13],其中过氧化物酶体自噬作为选择性自噬的一种,可以通过形成自噬体囊泡包裹
:.
段灵涛,等:希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26的功能分析3
过氧化物酶体,并将其运输至溶酶体或者液泡中进行降解,从而维持胞内过氧化物酶体的稳态[14]。先前的
研究表明,在过氧化物酶体自噬过程中,Atg8、Atg26与Atg30等基因具有十分重要的作用[15-17]。其中Atg26
基因编码一个甾醇葡萄糖基转移酶,OKU[16]等与NAZARKO等[11]发现Atg26在毕赤酵母(Pichiapastoris)
中是激活过氧化物酶体自噬活性的重要因素,YAMASHITA等[18-19]则发现毕赤酵母中Atg26可以通过调节
PI4P(phosphatidylinositol4'-monophosphate)的活性来启动过氧化物酶体自噬所需的从头膜合成过程,并
且Atg26对甾醇的转化是自噬体膜结构延伸和成熟所必需的,能够增强对过氧化物酶体的选择性降解。在
黄瓜炭疽菌()中,Atg26基因的缺失会影响侵染过程中附着胞内过氧化物酶体的降解,抑制
侵入菌丝的形成,从而使致病力下降,同时也会降低菌株的产孢量与生长速率[20];同样,在禾谷镰刀菌
(Fusariumgraminearum)与灰葡萄孢(Botrytiscinerea)中,敲除Atg26基因后会导致突变体菌株生长速
率与致病力明显下降,并且在禾谷镰刀菌中还会导致分生孢子与***基因表达量的降低[21],而在灰葡萄孢
中则另外导致菌落畸形、菌核黑化延迟以及对氧化胁迫的敏感性升高[22]。以上结果表明,Atg26基因在胞
内的过氧化物酶体自噬过程中具有十分重要的作用,尤其是对植物病原真菌的生长发育以及致病过程具有
重要的影响。但目前尚未见到Atg26基因在希金斯炭疽菌生长发育和与致病过程中的作用的相关报道。
因此,为了探究ChAtg26基因在希金斯炭疽菌生长发育与致病过程中所起到的作用,本研究利用黄瓜
炭疽菌CoAtg26基因序列在NCBI进行BLAST比对,设计特异性引物,对希金斯炭疽菌的Atg26基因进
行克隆和功能研究,并分析该基因在病菌侵染寄主过程中的表达模式,以期探究自噬相关基因在希金斯炭
疽菌生长发育与致病过程中的作用,从而为十字花科蔬菜炭疽病的防治提供理论依据。
1材料与方法
、植物材料与载体
本研究所用的希金斯炭疽菌()IMI349063国际标准菌株由华中农业大学黄俊斌教授惠
赠。拟南芥Col-0由本实验室保存。大肠杆菌(Escheriacoli)DH5ɑ菌株购于上海生工生物公司。根癌农
杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)AGL1以及敲除载体p821由本校群体微生物研究中心邓懿祯教授惠赠,
抗性标记为卡那霉素(kanamycin)与潮霉素(hygromycin)。回补载体p822-NeoR由本实验室保存,抗性
标记为卡那霉素(kanamycin)和新霉素(neomycin)。

基于希金斯炭疽菌IMI349063菌株的全基因组测序数据,我们利用黄瓜炭疽菌CoAtg26基因
(AB365481)序列来进行BLAST比对,获得了ChAtg26的基因与蛋白序列。在Pfam网站
()上对ChAtg26进行结构域分析。并在NCBI数据库中对ChAtg26序列进行BLAST
:.
段灵涛,等:希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26的功能分析4
比对,下载其他真菌的Atg26蛋白的序列,通过MEGAX软件来进行ClustalW比对,利用邻接法来构建
系统发育树。

将希金斯炭疽菌的孢子悬浮液接种于拟南芥叶片,放入培养箱中进行保湿培养(光照16h/26℃,黑
暗8h/25℃)。于8h、22h、40h、60h与72h分别取样提取RNA,反转录得到cDNA,然后以希金斯炭
疽菌的Actin基因作为内参基因,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ChAtg26基因的表达情况,相对
表达量采用2-ΔΔCt法计算。试验所用引物见表1。
Table1Primersusedinthisstudy
PrimersSequence(5'~3')
Actin-FCCCCAAGTCCAACAGAGAGA
Actin-RCATCAGGTAGTCGGTCAAGTCA
qP26-FGAGTTTGACCACCCAGAGG
qP26-RGACAGATAGCCCGACTTGAC
Atg26b-FTGTCCAGGTCTCCCGTCTC
Atg26b-RACATCACCGCACATACCACTT
Atg26j-FTTTCTTCAAGCAGATACCGAC
Atg26j-RCAGTGATGCCCCGACAAT
ΔAtg26b-FTGTCCAGGTCTCCCGTCTC
ΔAtg26b-RACATCACCGCACATACCACTT
ΔAtg26j-FTTTCTTCAAGCAGATACCGAC
ΔAtg26j-RCAGTGATGCCCCGACAAT
Hyg-FGGGCGTCGGTTTCCACTAT
Hyg-RGATATGTCCTGCGGGTAAATAGC
ChAtg26RT-FATCACCAAGATGGGCGC
ChAtg26RT-RAGGCCCAGGTAAAAGTGC
ChAtg26-probe-FTTTCCTCAGTCATCCATCA
ChAtg26-probe-RCTGCCGAGTACCTTTGTG
:.
段灵涛,等:希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26的功能分析5
Atg26HB1-FtatggagaaactcgagaattcAGATATACTGTATTTAGTTGGTGCTTGCA
Atg26HB1-RttgctcaccatGGCCGTCGAGGTTGCGCT
Atg26HB2-FtcgacggccATGGTGAGCAAGGGCGAGG
Atg26HB2-RcatCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
Atg26HB3-FtggacgagctgtacaagATGGCGACGCCTGGC
Atg26HB3-RctgCTAGGCTACCTGCTGCTG
Atg26HB4-FagcagcaggtagcctagCAGGCCGAGCAGGAGGAG
Atg26HB4-RccgggtaccgagctcgaattcCAATAACGTTGCACACTACCTTGA
CΔAtg26b-FTGTCCAGGTCTCCCGTCTC
CΔAtg26b-RACATCACCGCACATACCACTT
CΔAtg26j-FTTTCTTCAAGCAGATACCGAC
CΔAtg26j-RCAGTGATGCCCCGACAAT
GFP-FAGCTCGTCCATGCCGAGA
GFP-RGGGGTGGTGCCCATCCTG

。首先用内切酶HindⅢ与SalⅠ对p821质粒进行酶切
线性化,把ChAtg26基因上游1000bp的片段整合到p821上,获得p821-ChAtg26up,再用SacⅠ与EcoRⅠ
对p821-ChAtg26up质粒进行酶切线性化,将ChAtg26基因下游1000bp的片段整合到p821-ChAtg26up上,
从而获得ChAtg26基因的敲除质粒p821-Atg26ko。而后通过利用根癌农杆菌介导的转化(Agrobacterium
tumefaciensmediatedtransformation,ATMT)的方法,通过农杆菌AGL1将敲除质粒转入到希金斯炭疽菌野
生型(wildtype,WT)菌株的孢子中;同样,对ChAtg26基因进行敲除,通过含有50μg·mL-1潮霉素的PDA
平板对转化子进行了筛选。然后对获得的转化子进行DNA提取,用3对敲除验证引物ΔChAtg26b-F/R、
ΔChAtg26j-F/R与Hyg-F/R对转化子进行PCR验证。同时提取WT菌株与敲除转化子的总RNA,利用引物
ChAtg26RT-F/R进行RT-PCR验证。而后,以XbaⅠ作为酶切位点,ChAtg26基因上游1000bp作为探针,
对候选转化子进行Southernblot验证。
Ⅰ内切酶对p822-NeoR质粒进行酶切线性化,然后将ChAtg26
基因上游1500bp作为启动子序列,下游1000bp作为终止子序列,又在ChAtg26基因序列C端加入了一
:.
段灵涛,等:希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26的功能分析6
个GFP序列作为基因的荧光标记,而后将这4个序列通过同源重组方法整合到p822-NeoR线性化质粒上,
获得回补质粒p822-CΔChAtg26。同样,通过ATMT技术将回补质粒转入希金斯炭疽菌ΔChAtg26-2菌株中,
利用含有50μg·mL-1潮霉素与100μg·mL-1G418的PDA平板来对转化子进行继代筛选,并通过
CΔAtg26b-F/R、CΔAtg26j-F/R与GFP-F/R三对引物来对转化子进行PCR验证,以及提取转化子总RNA,
利用引物ChAtg26RT-F/R对转化子进行RT-PCR验证。

、ΔChAtg26与CΔChAtg26菌株边缘打下菌块,而后将其
接种于新的9cmPDA平板中央,28℃黑暗倒置培养7d,以WT为对照观察菌落形态并拍照,每个菌株
重复3次。
,之后每天使用十字交叉法测量菌落直径,计算菌株生长速率,
每个菌株重复3次。
,在28℃培养
箱中黑暗倒置培养8d后,揭下玻璃纸,对菌丝称重,每个菌株重复3次。
,在生长4d后切下菌落边缘的玻璃纸,而后将其放于载玻
片上,于显微镜下观察菌丝尖端的形态。
、,28℃,
200r·min-1摇培8d后,用纱布将分生孢子过滤出来,通过血球计数板测定产孢量。而后将分生孢子浓度调
整至1×106个·mL-1,抽取20μL孢子液滴于疏水载玻片上,将载玻片置于底部铺有湿润滤纸的培养皿中,
28℃光照下培养12h后统计孢子萌发率,培养24h后统计附着胞形成率,每个菌株重复3次。
·L-1HO、200μg·mL-1刚果红(CR,
22
CongoRed)的PDA平板中央,28℃黑暗倒置培养7d后测量菌落直径,每个菌株重复3次。

×106个·mL-1的分生孢子液,首先将孢子液均匀喷施至生长30d的拟南芥叶片
正反面上,于28℃、12h/12h光暗交替的气候箱中保湿培养5d后观察,并根据表2统计发病情况;同时
抽取20μL的孢子液滴于拟南芥的离体叶片上,于28℃气候箱中黑暗保湿培养3d后,用台盼蓝染色,观
察发病情况,每个菌株重复3次。
病情指数=[∑(病级叶片数×病级数值)/(叶片总数×发病最高级的代表数值)]×100。
:.
段灵涛,等:希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26的功能分析7

DiseaselevelSymptom
1Leavesnotinfected
2Thediseasedareadoesnotexceed1/3oftheleafarea
3Thediseasedareaismorethan1/3oftheleafarea,butlessthan2/3oftheleafarea
4Thediseasedareaexceeds2/3oftheleafarea
2结果与分析

希金斯炭疽菌ChAtg26基因序列长度为4778bp,具有3个内含子,1516个氨基酸,其翻译产物为甾
醇-3-β-葡萄糖基转移酶,包含3个结构域,从N端到C端依次为PHdomain,GRAMdomain与
Glycosyltransferasefamily28N-terminaldomain(图1-A)。我们从NCBI上下载了其他真菌Atg26蛋白的氨
基酸序列,通过MEGAX对这些氨基酸序列进行了ClustalW比对,并构建了系统发育树,结果显示ChAtg26
与黄瓜炭疽菌、非苜蓿轮枝菌(Verticilliumnonalfalfae)等在同一分支上(图1-B)。表明Atg26蛋白在不
同真菌中高度保守。
Fig1Diagramoffunctionaldomainpredictionandphylogenetictreeanalysisbasedonprotein

:.
段灵涛,等:希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26的功能分析8
A:PfamdomainanalysisofChAtg26,includingaPHdomain(purplearea),GRAMdomain(greenarea)andGlycosyltransferase
family28N-terminaldomain(redarea);B:PhylogenetictreeanalysisofChAtg26.

收集接种希金斯炭疽菌WT菌株分生孢子悬浮液8h、22h、40h、60h与72h后的拟南芥叶片,利用
qRT-PCR检测了ChAtg26基因在希金斯炭疽菌侵染寄主过程中的表达情况。结果显示,ChAtg26基因在接
种的0~40h之中均有较高的表达量,而在60h时表达量有显著性降低,但是在72h时表达量又有上调(图
2)。表明ChAtg26基因参与了希金斯炭疽菌的孢子萌发、附着胞与侵染钉的形成以及活体营养等阶段,而
对死体营养阶段可能没有重要影响。

Thedatainthefigurearethemean±
datawareanalyzedbytheOne-wayANOVA,differentlettersindicatesignificantdifferenceatP<.

为了研究希金斯炭疽菌ChAtg26基因的生物学功能,本研究通过ATMT技术将ChAtg26基因的敲除质
粒转入了希金斯炭疽菌的孢子中,利用同源重组的方法来进行ChAtg26的基因敲除(图3-A)。而后对候选
转化子进行了潮霉素抗性平板筛选与PCR验证,其中,ΔChAtg26b-F/R和ΔChAtg26j-F/R两对引物可以在
WT菌株DNA中分别扩增出1625bp和1219bp大小的条带,而在敲除突变体DNA中无扩增条带;Hyg-F/R
引物则可以在敲除突变体DNA中扩增出一条865bp大小的条带,而在WT菌株DNA中无扩增条带(图
3-B-D)。另外提取了转化子的总RNA,通过ChAtgRT-F/R引物对转化子进行了RT-PCR验证,该引物可以
在WT菌株中扩增出一条1000bp大小的片段,而在敲除突变体中无扩增条带。最终获得了ΔChAtg26-2
与ΔChAtg26-9共2个候选转化子。而后以XbaⅠ作为酶切位点,ChAtg26基因上游1000bp作为探针,对
候选转化子进行了Southernblot验证,可在WT菌株D