单分子荧光检测技术课件.ppt

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B200425010
前言
单分子检测技术
单分子荧光检测技术原理及应用
小结
前言
统计力学的各态遍历假设(ErgodicHypothesis):
系综个体物理量轨迹的时间平均等于该物理量在给定时间的系综平均
在包含完全相同个体的系综,测量时间足够长
系综测量和单分子测量结果相同
在均相体系:测量时间可能小于涨落时间
非均相体系:个体轨迹平均不等于系综平均
系综测量和单分子测量结果不等
单分子检测实验的重要性:
对非均相体系,可给出分子性质的分布信息
对均相和非均相体系,单分子轨迹即是分子性质涨落的直接记录,蕴涵丰富的动力学知识
单分子检测技术
扫描探针显微技术
(ScanningProbe
Microscopy)
光学和光谱技术
扫描隧道显微技术(STM)
原子力显微技术(AFM)
扫描离子电导显微技术(SICM)
光钳技术(OpticalTweezer)
荧光技术(Fluorescence)
扫描近场光学显微技术(SNOM)
单分子荧光检测原理
单分子荧光检测是单分子检测最常用的方法
标记在生物大分子上各个荧光基团的各种特性的变化反映了有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度及在化学和静电环境下活性改变的信息
对宿主影响小
稀溶液中荧光发射检测较为灵敏,背景值较低,信噪比高

T1
hA
hA
Absorption
10-15s
Vibrationalrelax,VR,10-1210-14s
Internalconversion,IC,10-1110-13s
Intersystemcrossing,ISC,10-210-6s
Fluorescence
Phosphorescence
IC
ISC
S0
S1
S2
3210
10-8s
10-3100s
hF
hP
JablonskiDiagram

在被照射的体积中只有一个分子与激光发生相互作用(调整研究体系的浓度或密度)
确保单分子的信号大于背景干扰信号(有效减少拉曼散射、瑞利散射及其杂质荧光所造成的干扰)

单分子的荧光寿命在由非辐射弛豫决定时对局域环境非常敏感,因此可以通过荧光标记生物大分子的某一特殊位置,检测生物大分子的构象运动。
虚线:单指数曲线拟合
实线:双指数曲线拟合