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何秋菊王丽琴
摘要豆浆水是中国传统书画修复中的施胶材料,加热可导致大豆蛋白产生热变性,使纸张产生不同程度的疏水性,从而影响到书画修复的效果。本研究利用8-苯***基-1-萘磺酸(ANS)荧光探针法分析大豆蛋白在加热过程中疏水性的变化;利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰***凝胶电泳(SDS-PAGE)分析加热前后的蛋白质差异条带,并以液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行蛋白鉴别;衰减全反射傅里叶变换红外光谱法(ATR-FTIR)去卷积、二阶导数曲线拟合分析不同加热温度豆浆水大豆蛋白二级结构的变化。ANS荧光探针实验结果表明,80℃的豆浆水的疏水性最大。SDS-PAGE与LC-MS/MS分析表明,加热消失的两个条带的蛋白分别为球蛋白GlycininG3亚基及糖蛋白凝集素Lectin亚基;ATR-FTIR分析表明,随着温度从25℃上升到80℃,大豆蛋白β-%%,α-螺旋、β-转角和无规卷曲结构向β-片层结构
转变,而β-片层结构含量与表面疏水性呈正相关,加热温度为80℃的豆浆水最适于书画修复。
Key豆浆水;加热温度;宣纸;大豆蛋白;疏水性
1引言
古书画修复是一种抢救、保护古旧残损书画作品的传统技艺。豆浆水作为天然植物蛋白胶结物用作书画修复用纸绢的施胶材料,以提高纸绢遇水的稳定性,避免书画在全色、接笔修复中颜色被暈开[1]。豆浆水中的大豆蛋白大部分是球形蛋白,带负电的谷氨酸和羟脯氨酸较多,具有一定的疏水性[2],可使纸张产生抗水性。加热会破坏蛋白分子的天然结构,导致其热变性以及其它理化性质的变化[3],如蛋白质溶解度下降[4],蛋白结构从聚合到展开状态,疏水区域暴露[5]。不同熟度的豆浆水会导致纸张产生不同程度的疏水效果,从而影响到修复效果。目前,在文物保护修复领域尚未见对不同加热温度豆浆水的疏水性研究报道。
ANS荧光探针是一种阴离子型探测剂,与蛋白质的疏水区域结合后,荧光强度明显增强,通过测定其荧光强度变化可表征蛋白质疏水性的强弱[6,7]。Alizadeh-Pasdar等[8]采用ANS荧光探针测定乳清蛋白分离物、β-乳球蛋白和牛血清白蛋白在80℃加热前后不同pH值时的表面疏水性,研究结果表明,体系pH值大小会影响蛋白质表面疏水性强弱。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰***凝胶电泳(SDS-PAGE)法是依据蛋白质分子量的差异进行分离,借助凝胶成像分析系统记录特征条带的光密度,实现了蛋白组份及其亚基的定性定量测定[9]。黄惠华等[10]采用SDS-PAGE法在大豆脱脂豆粕、“碱提酸沉”和“超滤法”分离蛋白中分离出17种蛋白组分,发现大豆水浸提液经高温处理后,对热敏感的
谱带解聚消失。衰减全反射傅里叶变换红外光谱法(ATR-FTIR)结合傅里叶去卷积和二阶导分峰、光谱拟合可定量测定蛋白质二级结构[11]。Muragama等[12]利用FTIR研究了牛血清白蛋白热变性过程中二级结构的变化,研究结果表明,随着温度升高,α-螺旋含量逐渐降低,β-转角和分子间β-片层等含量逐渐增加。
本研究将ANS荧光探针法及SDS-PAGE凝胶电泳法等方法应用于文物修复研究中,研究了不同熟度豆浆水大豆蛋白表面疏水性、加热前后大豆蛋白亚基及二级结构的变化,确定了书画修复用豆浆水的适宜加热温度,为豆浆水在纸质文物保护修复中的科学使用和机理研究提供依据。
2实验部分

POLARstarOmega多功能酶标仪(德国BMGLabtech公司);DJ12B-A10豆浆机(九阳公司);GEHoeferMiniVE垂直电泳系统(美国GE公司);DionexUltimate3000液相色谱系统、LTQ-OrbitrapVelospro质谱仪(美国Thermo公司);Alpha便携式傅里叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司)。
大豆(市售黄豆);Na2HPO4、NaH2PO4、十二烷基硫酸钠(SDS)、异丙醇(分析纯,西陇化工公司);ANS(分析纯,美国Sigma公司);Tris-HCl缓冲溶液、考马斯亮蓝R-250(上海生工公司);甘氨酸(美国Amersco公司,BR);蛋白Marker(10~180kDa,美国ThermoScientific公司);二硫苏糖醇、甘油、溴酚蓝、乙醇、冰醋酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);乙***、甲醇、甲酸(质谱级,德国Merck公司)。

℃浸泡12h,采用豆浆机果汁功能打散搅拌20min后,用过滤网滤掉残渣,制得大豆含量分别为3%和10%(w/V)的生豆浆水。将生豆浆水在水浴锅中分别加热至50℃、80℃、95℃,并保温20min,然后过滤去渣,得到不同熟度的豆浆水,冷却至室温,备用。
%(w/V)-NaH2PO4缓冲液(PB,)中,室温搅拌20min,用高速均质机均质2min,10000r/min离心30min。采用Bradford法[13,14]测定不同熟度豆浆水溶液中大豆蛋白浓度,~。取稀释后的样品溶液2mL,分别加入50mmol/LANS溶液16μL,振荡后静置3min,利用多功能酶标仪测定样品的荧光强度(FI)。使用ANS作为外源荧光探针测定溶解于PB溶液中蛋白质的表面疏水性[15],激发波长(λex)为355nm,发射波长(λem)为520nm,狭缝宽度为5nm。以FI对蛋白质浓度作图,初始段的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数S0。
-PAGE分析将上样缓冲液(200mmol/LTris-HCl,200mmol/L二硫苏糖醇,8%(w/V)SDS,%溴酚蓝,20%甘油)分别与10%(w/V)不同熟度的豆浆水以体积比1∶3混合。样品和蛋白标准品点样电泳的上样量分别为10μL和3μL。电泳缓冲液为250mmol/LTris-HCl、、1%SDS。浓缩胶上施加电压140V,电泳时间30min。当染料前沿进入分离胶后,将电压提高至160V,约90min后,待溴酚蓝电泳出胶槽即停止电泳。取出凝胶,用考马斯亮蓝染色液(%(w/V)考马斯亮蓝R-250,25%(V/V)异丙
醇,10%(V/V)冰醋酸)染色,脱色液(150mL乙醇,50mL冰醋酸,300mL超纯水)脱色至电泳带清晰,以凝胶成像系统成像并采集数据。
-串联质谱(LC-MS/MS)分析从SDS-PAGE电泳凝胶中切取分辨较好、加热后有差异的蛋白质条带进行LC-MS/MS检测。方法如下:,对染色的蛋白质条带按照质谱制样的要求,进行脱色、还原、烷基化、酶解、萃取和脱盐等处理[16]。经离心浓缩干燥后,%(V/V)甲酸溶液复溶,高速离心后,取10μL上清液进行LC-MS/MS分析。HPLC分析使用C18毛细管柱(200mm×75μm,5μm),%(V/V)甲酸,流动相B为80%(V/V)乙***-%(V/V)甲酸,梯度洗脱程序:0~5min,98%A;5~43min,95%A;43~52min,80%A;52~54min,65%A;54~60min,100%B。。质谱分析采用ESI源,正离子扫描方式,一级质谱扫描范围m/z400~1500,在35%归一化碰撞能(CID)下,选择一级图谱中峰强度最高的20个峰在离子阱中进行相关MS/MS扫描。,在uniprot-(/)大豆库中搜索MS/MS谱对应蛋白。固定修饰:烷基化(C);可变修饰:氧化(M);反库搜索;酶:胰酶;最大漏切位点数:2;一级质量偏差:10ppm;二级质量偏差:。
-FTIR分析在载玻片上制备不同加热温度的豆浆水膜,待干后揭下,用于ATR-FTIR分析。检测范围540~4000cm1,分辨率4cm1,,扫描次数64次,温度25℃。,以消除样品用量对红外光谱强度的影响。对酰***Ⅰ带(1700~
1600cm1)进行去卷积处理,半峰宽为10cm1,。。多次拟合使残差最小(r2≥),确定各子峰与二级结构的对应关系后,根据其积分面积计算各种二级结构的相对百分含量。
3结果与讨论

图1为采用ANS荧光探针分析不同熟度豆浆水中大豆蛋白样品表面疏水性指数S0的结果。随着加热温度的升高,大豆蛋白的S0值呈上升趋势;80℃时S0值最大,疏水性最强;但当温度高于80℃时,S0值略有降低,表面疏水性呈下降趋势。据报道,蛋白质表面疏水性与空间构象、氨基酸及亚基组成密切相关[17],因此,以下实验分别从大豆亚基组成和二级结构两方面研究其对表面疏水性的影响。
-PAGE电泳法联用LC-MS/MS分析
经过SDS-PAGE电泳分离和考马斯亮蓝染色所得的豆浆水分析结果如图2所示。结果表明,加热至80℃时,豆浆水中分子量约在55和35kD处的两个蛋白条带消失(图2方框所示)。这两个条带经胰酶酶解后,利用LC-MS/MS分析,在Uniprot大豆庫中搜索,结果如表1所示,每个差异条带经分析筛选后,共得到3种潜在的蛋白。其中,加热后消失的55kD处的条带1潜在蛋白为大豆球蛋白的一种亚基,分值最高的为球蛋白GlycininG3亚基。消失的35kD处的条带2潜在蛋白分值最高的为糖蛋白凝集素Lectin亚基。结果表明,加热温度超过80℃后,大豆蛋白可能发生热变性,导致沉淀。
-FTIR分析
不同加热温度下豆浆水的红外光谱见图3。1600~1700cm1处的酰***Ⅰ带C=O伸缩振动是计算蛋白二级结构的主要谱带[18],其中1610~1640cm1对应β-片层,1640~1650cm1为无规卷曲,1650~1660cm1为α-螺旋,1660~1700cm1为β-转角[19],通过对酰***Ⅰ带傅里叶去卷积和二阶导分峰拟合可得到蛋白质二级结构相对变化(图4)。
由图4可知,不同加热温度的豆浆水中的大豆蛋白质二级结构发生了改变,通过计算各子峰积分面积得到二级结构定量信息(表2)。由表2可见,随着加热温度由25℃上升到80℃,β-%%,温度至90℃%;相对应的α-螺旋、β-转角和无规卷曲结构的相对含量先减小再增加,说明随着加热温度从25℃上升到80℃,蛋白质中α-螺旋、β-转角和无规卷曲向β-片层结构转化。,80℃加热的豆浆水的疏水性最大。本研究结果表明,大豆蛋白中,β-片层结构含量与表面疏水性呈现正相关,此结论与文献[20,21]的研究结果一致。产生的原因可能是蛋白质分子β-片层含量较高时,分子结构相对松散,蛋白质分子内部“埋藏”的酪氨酸和色氨酸残基的疏水性位点的暴露程度较大,表现出更强的表面疏水性。
4结论
研究了书画修复中宣纸施胶用不同加热温度豆浆水大豆蛋白的疏水性,初步探讨了疏水性变化机理。结果表明,随着加热温度从25℃上升到80℃,大豆蛋白β-%%,α-螺旋、β-转角和无规卷曲结构向
β-片层结构转变,β-片层结构含量与表面疏水性呈现正相关,80℃的豆浆水的疏水性最大,因此最适用于书画修复。
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