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铜对蚯蚓转化牛粪过程抗生素抗性基因的影响
***
田雪力,李仲瀚,杨凤霞,韩秉君,张克强(农业农村部环境保护科研监测所,天津300191)
摘要:以赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)为试验蚓种,设定不同Cu浓度梯度,,不同Cu浓度处理
下,ARGs累积总丰度呈现出CF(未添加Cu)<T3(高浓度,1000mg/kg)<T1(低浓度,100mg/kg)<T2(中浓度,500mg/kg),
-1-1
××10copies/、中浓度Cu的添加显著提高了样品中ARGs的总丰度水平
(P<).通过研究不同类型ARGs在不同时间阶段的变化,发现低、高浓度Cu处理组(T1、T3)在蚯蚓转化过程中提高了tet-ARGs、erm-ARGs和
str-ARGs的丰度,而中浓度Cu处理组(T2)中tet-ARGs和str-(RDA)得出pH值显著影响蚯蚓转化过程中ARGs相对丰度的
变化(P<),且TOC、,一定程度上能够减少其环境风险,但牛
粪中Cu的残留可导致蚯蚓转化过程中部分ARGs的富集,因此亟需进一步优化蚯蚓转化处理工艺.
关键词:重金属铜;蚯蚓;牛粪;转化过程;抗生素抗性基因
中图分类号:X750文献标识码:A文章编号:1000-6923(2022)10-4688-08
-li,LIZhong-han,YANG
Feng-xia*,HANBing-jun,ZHANGKe-qiang**(Agro-EnvironmentalProtectionInstitute,MinistryofAgricultureandRuralAffairs,
Tianjin300191,China).ChinaEnvironmentalScience,2022,42(10):4688~4675
Abstract:Inthisstudy,Eiseniafetidawasusedastheexperimentalearthworm,differentCuconcentrationgradientsweresetto
,underdifferentCu
concentrations,thetotalabundanceofARGsshowedatrendofCF(withoutCuaddition)<T3(highconcentration,1000mg/kg)<T1
(lowconcentration,100mg/kg)<T2(mediumconcentration,500mg/kg).Comparedwiththecontrolgroupwithoutearthworm,the
×10-×10-1copies/
additionoflowandmediumconcentrationsofCusignificantlyincreasedthetotalabundanceofARGsinthesamples(P<).By
studyingthechangesofdifferentARGsubtypesindifferenttimestages,wefoundthatthelowandhighconcentrationofCu
treatmentgroups(T1,T3)increasedtheabundancesoftet-ARGs,erm-ARGsandstr-ARGsduringearthwormconversion,whilethe
abundancesoftet-ARGsandstr-ARGsdecreasedinthemedium-concentrationCutreatmentgroup(T2).Redundancyanalysis(RDA)
showedthatpHsignificantlyaffectedtherelativeabundanceofARGsduringearthwormconversion(P<),andTOC,TN,andCu

reduceitsenvironmentalrisktoacertainextent,buttheresidualCuincowdungwouldleadtotheenrichmentofsomeARGsduring
earthwormconversionofcowdung,thusitwasurgenttofurtheroptimizethetreatmentprocessofearthwormconversion.
Keywords:copper;earthworm;cowdung;conversionprocess;antibioticresistancegenes
近年来,养殖业的迅速发展产生大量的畜禽粪(ARGs).研究发现,磺***类、四环素类抗性基因在牛
[6-7][8]
便,,
[1][2]
%,在粪便中检出了blaOXA-1、blaTEM-1和blaampC等与人
如何做好畜禽粪污的无害化处理与资源化利用,提类健康密切相关的β-内酰***
,粪便中ARGs的丰度与其含有的抗生素以及***、铜
[3]
牛粪不仅含有丰富的有机质,而且含水量大、保等重金属浓度显著相关,且***、铜等重金属和抗生素
[9]
水性强、透气性好、发热量低,,
:2022-03-23
为了促进动物生长、提高产量,重金属常被用做基金项目:国家自然科学基金资助项目(42077355,41807399);所级基础前
[4]沿任务资助项目(2022-jcqyrw-dyz);中央级公益性科研院所基本科研业
添加剂被广泛添加在畜禽饲料中,其中只有少部
务费资助专项(Y2021PT01)
分被吸收利用大部分重金属以粪便的形式排出[5]
,.*责任作者,副研究员,******@;**研究员,
与此同时,畜禽粪便中也检出丰富抗生素抗性基因******@
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:、含
性,并且还能对多种抗生素产生抗药性,%、%、%.
[10][11]

在微宇宙实验中发现水中ARGs及耐药菌的检出频试验体系以牛粪为主料,添加少量养殖基质供
,共设5个处理,,CK
;CF(未添加Cu+蚯蚓)、T1(低浓度
在重金属存在的情况下蚯蚓转化引起ARGs的变化100mg/kgCu胁迫+蚯蚓)、T2(中浓度500mg/kgCu
+蚯蚓)、T3(高浓度1000mg/kgCu胁迫+蚯蚓)

研究对象,利用实时荧光定量PCR技术,追踪考察不加剂且生物毒性较强的Cu进行试验,根据牛粪中重
同浓度Cu胁迫下蚯蚓转化牛粪过程中ARGs的消金属Cu的实际残留量范围(5~1257mg/kg)设置3个
.
时段样品中ARGs的丰度,并分析蚯蚓转化牛粪过按照分组要求将牛粪用重金属Cu处理,具体方
程中不同环境因子(TN、TP、含水率、TOC、pH值法:用无菌蒸馏水将牛粪调整至含水量70%左右,向
等)的变化规律及其对ARGs的贡献,旨在揭示蚯蚓不同试验处理组加入不同量的重金属CuSO4,使得
转化牛粪过程中重金属影响ARGs的潜在机制,为两者在牛粪基质中添加浓度梯度分别为100,500,
采取适合措施以减轻蚯蚓养殖场环境中ARGs的传1000mg/kg,混匀后分别装入塑料养殖盒(盒底直径
,盒口直径15cm,)中,并做好标记,每
盒装200g;而空白组即为未添加重金属Cu作为对照;
1材料与方法
然后取30条蚯蚓均匀地放置在每盒的牛粪基料上,
,并用3层纱布封盖,
供试蚯蚓为赤子爱胜蚓(Eiseniafetida),为本实保证透气并防止蚯蚓逃跑,同时为保持水分和湿度,
验室饲养,,
环境下驯化30d,实验时挑选健康、带有明显生殖环于第1,7,14,28,35,42,49d进行破坏性取样,收集蚯蚓
带的蚯蚓,用无菌水清洗表面后放置于装有湿润滤与培养基质.
纸的干净烧杯中,暗环境下保持24h,

[12]
供试牛粪采自本实验站自养泌乳奶牛,经混匀表1.
表1样品测定指标与方法
Table1Indicatorsandmethodsofsampledetermination
测定指标测定方法方法标准号
全氮(TN)有机肥料(蒸馏滴定法)NY525-2012
全磷(TP)有机肥料(分光光度法)NY525-2012
有机质有机肥料(***钾容量法)NY525-2012
含水率复混肥料中游离水含量测定(真空烘箱法)GB8576
pH值土壤pH值的测定(电位法)NYT1377-2007
铜(Cu)土壤质量铜、锌的测定(火焰原子吸收分光光度法)GB/T17138
,USA)和琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量.
试剂盒(MPBiomedicals,LLC,SantaAna,CA,美国)提取与检测完成后,将DNA样品放置于-20℃冰箱
,采用超微量中暂存.
紫外可见光分光光度计NanoDrop2000(
4690中国环境科学42卷
ARGs进行qPCR检测,即磺***类抗生素抗性基因抗性基因(qnrS、qnrB、oqxB)的检出率最低,平均为
sul-ARGs(sul1、sul2)、%.上述结果表明,蚯蚓转化牛粪过程中,ARGs
tet-ARGs(tetO、tetQ、tetW、tetL、tetX)、喹诺***存在普遍,具有种类多样、多种耐药机制并存的污染
类抗生素抗性基因qnr-ARGs(qnrS、qnrB、oqxB)、特点;且大部分基因可跨越这个阶段,依然以一定浓
大环内酯类抗生素抗性基因erm-ARGs(ermB、度而残留在转化产物蚓粪中,增加了蚓粪的后续利
[15-16]
ermC),链霉素类抗生素抗性基因str-ARGs(strA、用风险.
strB、aadA)、β-内酰***类抗生素抗性基因bla-ARGs
(blaGES-1、blaOXA-1、blaTEM-1、blaampC)、多粘菌素抗
性基因(mcr-1)、***霉素抗性基因(cfr、fexA).使用仪
器7500实时荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems,
美国)
度与标准曲线的定量范围,研究中将DNA样品用
µL,包
µLTBGreenPremixExTaq(TliRNaseH
Plus,Takara)、µL、µLROX
ReferenceDyeII、µµLDNA模板.
每个DNA模板设置3个平行,无菌水为阴性对
图1蚯蚓转化过程中不同时间阶段ARGs丰度的变化
照,qPCR反应程序和标准曲线的制作参照文献[13].


stagesduringearthwormconversion
(抗生素抗性基因拷贝数/16SrRNA拷贝数),NULL为未检出
析,以P<
pheatmap包制作热图,Origin95绘制了柱状图和折如图1所示,在CK中,除了qnr-ARGs及mcr-1,
线图,,tetW、tetX、sul1、
丰度(ARGscopies/16SrRNAgenecopies)、平均值sul2、strA、strB和aadA赋存水平相对较高,数量级
-4-1
~10copies/16Scopies;而喹诺***类ARGs
-8-7
中qnrS和oqxB的相对丰度仅为10~10copies/16S
2结果与讨论
,相对丰
、sul2,这可能是因为重金属Cu
[17]

在考察的24种ARGs亚型中,仅qnrS未检出,研究中检测的关于tet-ARGs中,丰度最高的基因亚
其余23种亚型在蚯蚓转化牛粪的不同时间阶段均型为酶修饰基因tetX,且随着Cu浓度升高tetX丰度
有检出,%~100%.总体来看,也升高,原因可能是添加的重金属浓度不同导致蚯
[18]
磺***类(sul-ARGs)、四环素类(tet-ARGs),与未添加蚯
类抗性基因(str-ARGs)存在较为普遍且污染水平较蚓的CK处理组相比,添加蚯蚓的处理组CF、T1、
高,这可能与畜禽养殖过程中因该类抗生素价格低T2和T3中ARGs的赋存多样性有所降低,此结果表
,从相
遍有关,从而导致了转化底物牛粪中相应的ARGs对丰度来看,添加蚯蚓CF与未添加蚯蚓组CK相比,
[14]
,在蚯蚓转化过程中,
与人类健康密切相关的高风险β-内酰***类ARGs而,蚯蚓转化后,转化产物蚓粪中依然存在多种
[19]
(blaNDM-1、blaGES-1、blaOXA-1、blaTEM-1、blaampC)
基质中的检出率也较高(%~100%);而喹诺***类蚓肠道中的ARGs进行研究中也发现,饲喂鸡粪和
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污泥后显著增加了蚯蚓肠道中ARGs的丰度及多样ARGs水平最高的亚型均为sul2(~),占总丰
性,蚯蚓作为动物转化的关键,%~%.此外,虽然与人类健康密切相
样性的增加说明蚯蚓肠道是ARGs的储存库,这可关的高风险bla-ARGs在总丰度中占比较低,但其中
能也是蚯蚓转化污泥及畜禽粪便难以完全去除的blaOXA-1、blaTEM-1和blaampC亚型检出率极高,分
,也应引起重视.
由图2可见,不同Cu浓度处理下ARGs总丰度
呈现出CF<CK<T3<T1<T2的趋势,整体相对丰度水
~,加入蚯蚓
后(CF组)
低浓度和中浓度的Cu可显著提高样品中ARGs的
总丰度水平(P<),且中浓度处理组T2中的ARGs
丰度水平增加最高,,其次为低浓度
处理组T1处理,
内,随着Cu浓度的增加,ARGs总丰度也增加,此结果
进一步验证了重金属可以通过协同选择和交叉选
择增加ARGs的丰度[12].Cu浓度最高的T3处理组中
ARGs的总丰度低于T1和T2组,这主要是因为低、
中浓度的Cu对ARGs筛选与传播的促进作用致使图2不同Cu浓度处理下基质中ARGs的总相对丰度

T1和T2组ARGs丰度增加[20],而高浓度Cu对微生
differentlevelsofCu
物活性的抑制作用又限制了T3处理组中ARGs的
增殖[21].从ARGs的类别来看,
品中的优势基因主要为sul1、sul2和tetX,各处理中消长变化规律
CKCFT1T2T3
图3不同种类ARGs在不同时间阶段的变化

在所检测的8类ARGs中,sul-ARGs的丰度最高,bla-
4692中国环境科学42卷
中的消长趋势存在差异,如sul-ARGs,在对照组CK可能是因为该浓度的Cu通过促进蚯蚓的生长,提高
的相对丰度在第7d达到最大值,然后降低并趋于了蚯蚓的处理效率,进而降低了牛粪中的ARGs,此
稳定;在CF和T3处理组sul-ARGs的相对丰度在种猜测有待进一步证实.
蚯蚓转化过程中的变化趋势与CK对照组基本一致;
但T1和T2处理组中sul-ARGs的相对丰度在第的差异分析
14d达到最大值,峰值出现时间后移,且T2在第7d由图4可见,经过49d的蚯蚓转化后,产物中大
和14dsul-ARGs的相对丰度显著(P<)高于CK多数ARGs有降低现象,而部分亚型如sul2、strA和
-ARGs,在CK、T1和T3处理blaGES-1的含量水平经蚯蚓转化后却在所有处理中
组均在第14d达到峰值,
则出现在第7d,第14d出现丰度下降,:blaampC中CF处理升高,其余处理降低.
与sul-ARGs和tet-ARGs不同,str-ARGs在CK、说明加入蚯蚓导致其升高,但是加入重金属Cu后对
T1、T2和T3的最大值均出现在第14d,且在所选定其有去除作用,且差异显著(P<).基因qnrB在T1
的8类抗性基因中,蚯蚓转化对str-ARGs的去除效和T2处理中升高,
果最好,且中浓度Cu处理组T2对str-ARGs去除效照组CF中未显著降低,可能是因为该基因主要存在
[22]
,较难去除,但由于试验组中高
[24]
低浓度和高浓度的Cu(T1、T3)处理提高了蚯蚓浓度Cu对革兰氏阴性菌具有抑制作用,从而导
转化不同阶段中大部分的ARGs的丰度,如tet-致tetX的丰度在添加Cu浓度最高的处理组T3中
ARGs、erm-ARGs和str-.
属Cu的残留会导致蚯蚓转化过程中多类ARGs的tetL为外排泵基因,存在于细菌细胞膜上,可外
[22]
,添加重金属Cu对tetL的去除
Zn对好氧堆肥过程中ARGs的影响,发现模拟的2在CK、CF、
个Cu浓度(200和500mg/L)均增加了包括四环素菌暴露于Cu存在的环境中时,生物膜将会被诱导生
类、大环内酯类和喹诺***类中5种ARGs亚型的丰长,同时导致存在于细菌细胞膜上的外排泵基因增
[23][25]
,但蚯蚓
,这可能是由于蚯蚓肠道中存
度Cu处理组T2中,sul-ARGs、tet-ARGs和str-在oqxB基因,
ARGs的丰度在蚯蚓转化后均较初始值降低,此结果可以针对蚯蚓肠道进行研究.
图4蚯蚓转化前后ARGs的变化


关系的潜在因素,本研究通过冗余分析确定ARGs与重
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[30]
,
ARGs差异影响最大的因素是pH值含量,占贡献率物的自我复制过程,从而对ARGs的传播产生影响,
[31]
%.如图5所示,含水率与基因tetM、tetW、,蚯蚓转化牛粪虽然在
tetL、tetQ、strA、aadA、strB、blaNDM-1、cfr、fexA、一定程度上降低了牛粪中ARGs的多样性和丰度,
blaTEM-1、sul2、mcr-1和blaGES-1成正相关,含水率但在处理后的蚓粪中仍有ARGs,其中包括高风险的
升高,上述基因丰度增加,故在实际养殖过程中可以bla-ARGs,它们在蚯蚓养殖环境、农田环境甚至食
在保证蚯蚓存活的条件下降低养殖基质中的含水物链的残留和流动不容忽视.

3结论
blaOXA-1、blaampC、blaNDM-1、blaOXA-1、oqxB、qnrB、
tetO、tetW、tetX、tetL、tetM、ermB、,且污染最为严重
-30
呈正相关(P<).此外,大部分ARGs指向Cu处理的是sul-ARGs(sul1和sul2,10~10),其次是tet-
-40
所在的第三象限,说明Cu的加入使得ARGs的相对ARGs(tetX、tetW和tetO,10~10)和str-ARGs(strA、
-1-3
,前人研strB和aadA,10~10),令人担心的是,一些与人类
[26]
(如blaampC、blaOXA-1
[10]
-1)在蚯蚓转化过程中亦普遍存在.
重金属在环境中很难降解,,与未加
,加入蚯蚓的CF处理中
-1
×10copies/16Scopies
-1
移并存在于植物根内,×10copies/16Scopies,且发现蚯蚓转化
[27-28][29]
到达植物叶片,-ARGs的去除效果较佳,中浓度Cu处理组的
[1]
种重金属和ARGs,如果直接施用于农田,可能存在效果最优.
,不同类型ARGs在蚯蚓转
化过程中的消长规律存在差异,且粪污中Cu的残
留可导致蚯蚓转化过程中多类ARGs的富集,其累
积总丰度整体呈现出CF(未添加Cu)<T3(高浓度,
1000mg/kg)<T1(低浓度,100mg/kg)<T2(中浓度,
500mg/kg)的趋势.
,牛粪基质理化因子的变
化对ARGs的消长起到了直接或间接的作用,其中
pH值是影响ARGs增殖扩散的主要因子,通过明确
该过程中ARGs变化的影响因素对于进一步优化牛
粪-蚯蚓养殖环境、削减ARGs丰度、抑制ARGs
的传播有重要作用.
参考文献:
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[1]TianXL,HanBJ,LiangJF,

genes(ARGs)duringearthwormconversionofcowdunginnorthern
physicochemicalpropertiesduringearthworm
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牛粪样品中的TN和TP水平也是造成样品间利用分析[J].农业环境科学学报,2020,39(6):1168-1176.
差异的部分原因,这表明动物的饲料结构可能会影WUHW,SunXQ,LiangBW,
4694中国环境科学42卷
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[3]GongX,LiS,CarsonMA,[14]张俊华,陈睿华,刘吉利,
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