分子生物学实验十二.ppt

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第3周
分子生物学实验仪器设备简介和实验有关内容介绍
第4周
从植物组织提取DNA
第5周
从动物组织提取DNA
第7周
原核细胞质粒DNA的提取
第8周
核酸的琼脂糖凝胶电泳
第9周
紫外分光光度法测定核酸含量和纯度鉴定
第10周
限制性内切酶酶切质粒DNA
第11周
凝胶电泳回收和纯化DN***段
第12周
细菌感受态的制备
第13周
质粒DNA的转化
第14周
目的基因的PCR扩增与检测
第15周
原核蛋白质SDS-PAGE电泳
第17周
考试
分子生物学实验十二
:
利用SDS-PAGE电泳检测表达蛋白,确定蛋白质的分子量。并掌握其原理与方法。
:
天然蛋白质在电场中泳动的迁移率主要取决于所带电荷的多少、分子量的大小以及分子形状等因素。1967年Shapiro等人发现,在有阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate-SDS)存在时,蛋白质的迁移率主要取决于它的分子量大小,而与其所带电荷的多少以及形态无关。
分子生物学实验十二
SDS能够打开蛋白质的氢键和疏水键,使蛋白质变性为松散的线状。同时大多数蛋白质能够按每个氨基酸与固定量的SDS结合,形成蛋白质-SDS复合物。其结果:1、SDS带有很强的负电荷,所以使SDS-复合物都带有相同密度的负电荷,其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,基本掩盖了不同种类蛋白质分子原有的电荷差别;2、SDS与蛋白质结合后改变了蛋白质原有的构象,使所有蛋白质水溶液中的形状都近似长椭圆柱形。不同蛋白质-SDS复合物的短轴直径都一样,约为18A,而长轴则与蛋白质分子的大小呈正比。这样SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率,就不受蛋白质原有电荷及形状的影响,而取决于椭圆柱的长度,即蛋白质分子量的大小。
分子生物学实验十二
不同浓度的聚丙烯酰***适用于不同范围的蛋白质分子量大小的测定。
聚丙烯酰***凝胶电泳是以人工合成的聚丙烯酰***凝胶作为支持剂的一种电泳方法。聚丙烯酰***是由丙烯酰***简称Acr(Acrylamide)和甲叉双丙烯酰***简称Bis在催化剂作用下聚合而成。TEMED称为四***乙二***作为催化剂,AP过硫酸铵作为活化剂。AP活化TEMED,活化的TEMED催化丙烯酰***结合成长链,并由甲叉双丙烯酰***的横链连接起来,形成立体的网状结构,因此甲叉双丙烯酰***是一种引入横链的交联剂。这样一定比例的丙烯酰***(简称Acr)和甲叉双丙烯酰***(简称Bis)在AP和TEMED催化下就能够形成一种具有多孔、多分枝而又相互连接的聚丙烯酰***凝胶。
分子生物学实验十二
聚丙烯酰***胶液灌入玻璃管中,凝固后垂直电泳称为管状电泳,灌入两块玻璃板之间的狭缝中,凝固后垂直电泳称为板状电泳。聚丙烯酰***凝胶电泳系统,可以仅有一种浓度的凝胶,一种pH值和一种缓冲液组成,称为连续系统;也可以有两种以上不同浓度的凝胶、pH值及缓冲液组成,称为不连续系统。
分子生物学实验十二

诱导的细菌裂解液,制胶夹,电极架,移液器

配制储存液:(1)30%凝胶贮液(W/V):(丙烯酰***);(甲叉双丙
烯酰***),定容至100毫升。过滤,4C,棕色瓶避光保存有效期为30天。
(2)10%SDS:.,过滤,室温备用。
(3)电极缓冲液():(三羟***氨基甲烷);;1gSDS,
。室温贮存。
(4)-HCl缓冲液():;
溶解后用浓HCl粗调pH,,定容至200毫升。4C贮存。
(5)缓冲液():;.
溶解后用浓HCl(12N)粗调pH,用1NHCl精调pH,定容至200ml。4C贮存。
(6)10%AP:.,现配为好。
(7)TEMED:冰箱保存。
(8)样品缓冲液:-HCl();;%SDS;
-巯基乙醇;.;混匀后,4C备用。
(9)无水乙醇
(10)脱色剂:500ml无水乙醇;160ml醋酸,定容至2000ml,室温备用.
(11)染色液:
300ml脱色液;考马斯亮兰R250;溶解,过滤,棕色瓶室温贮存。
分子生物学实验十二
;。板状电泳中,电泳凝胶分为两层;上层胶为低浓度的大孔胶,称为浓缩胶或成层胶,此胶的缓冲液是Tris-HCI,;下层胶则为高浓度的小孔胶,称为分离胶或电泳胶,此胶的缓冲液是Tris-HCI,;电极缓冲液则是Tris-HCI,甘氨酸。
非连续的聚丙烯酰***凝胶电泳过程中存在有三种物理效应:(1)样品的浓缩效应,(2)分子筛效应,(3)电荷效应,由于这三种物理效应,使样品分离效果好,分辨率高。
分子生物学实验十二
分子生物学实验十二
:(1)用无水乙醇把电泳槽、玻璃板等一系列用品擦洗干净。
(2)安装好制胶装置。
依次加入下列试剂配制12%的下层胶(5ml):
.
Acr/Bis储存液
-HCl()
10%SDS
10%AP
TEMED



50l
50l
4l
混匀后灌胶,上铺一层无水乙醇,分层后倒出乙醇,吸干
依次加入下列试剂配制5%的上层胶(2ml):



()
20l
20l
4l
分子生物学实验十二