气相色谱仪使用方法及实验操作步骤.docx

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气相色谱仪使用方法及实验操作步骤:
A、翻开氮气、氢气、空气发生器的电源开关(或氮气钢瓶总阀),调整输出压力稳固在左右(气体发生器
一般在出厂时已调整好,不用再调整)。
B、翻开色谱仪气体净化器的氮气开关转到“开”的地点。注意察看色谱仪载气B的柱前压上涨并稳固大
约5分钟后,翻开色谱仪的电源开关。
C、设置各工作部温度。TVOC剖析的条件设置:(a)柱箱:柱箱初始温度50℃、初始时间10min、升温速率
5℃/min、停止温度250℃、停止时间10min;(b)进样器和检测器:都是250℃。脂肪酸剖析时的色谱条件:
柱箱:柱箱初始温度140℃、初始时间5min、升温速率4℃/min、停止温度240℃、停止时间15min;(b)
进样器温度是260℃,检测器温度是280℃。
D、点火:待检测器(按“显示、换档、检测器”可查察检测器温度)温度升到150℃以上后,翻开净化
器上的氢气、空气开关阀到“开”的地点。察看色谱仪上的氢气和空气压力表分别稳固在和左右。按住点
火开关(每次点火时间不可以超出6~8秒钟)点火。同时用光亮的金属片凑近检测器出口,当火点着时在金
属片上会看到有显然的水汽。假如在6~8秒时间内氢气没有被点燃,要松开点火开关,再从头点火。在点
火操作的过程中,假如发现检测器出口内白色的聚四***帽中有水凝固,可旋下检测器采集极帽,把水清理
掉。在色谱工作站上判断氢火焰能否点燃的方法:察看基线在氢火焰点着后的电压值应高于点火以前。
、翻开电脑及工作站(通道一剖析脂肪酸,通道二剖析碘),翻开一个方法文件:脂肪酸剖析方法或碘剖析方法。显示屏左下方应有蓝字显示目前的电压值和时间。接着能够转动色谱仪放大器面板上点火按钮
上面的“粗调”旋钮,检查信号能否为通路(转动“粗调”旋钮时,基线应跟着变化)。待基线稳固后进样
品并同时点击“启动”按钮或按一下色谱仪旁边的快捷按钮,进行色谱数据剖析。剖析结束时,点击“停
止”按钮,数据即自动保存。
、关机程序:第一封闭氢气和空气气源,使氢火焰检测器灭火。在氢火焰熄灭后再将柱箱的初始温度、
检测器温度及进样器温度设置为室温(20-30℃),待温度降至设置温度后,封闭色谱仪电源。最后再封闭氮气。
高效液相色谱
我国药典收载高效液相色谱法项目和数目比较表:
方法
项目
数目
1985年版
1990年版
1995年版
2000年版
鉴识
9
34
150
HPLC法
检查
12
40
160
含量测定
7
60
117
387
鉴于HPLC应用在药品剖析中愈来愈多,所以每一个药品剖析人员应当掌握并应用
HPLC。
二、HPLC的特色和长处
HPLC有以下特色:
高压——压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。
高速——流速为~ml/min。
高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分别成份可达100种。
高敏捷度——紫外检测器敏捷度可达。同时耗费样品少。
HPLC与经典液相色谱对比有以下长处:
速度快——往常剖析一个样品在15~30min,有些样品甚至在5min内即可达成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最正确分别成效。
敏捷度高——紫外检测器可达,荧光和电化学检测器可达。
柱子可频频使用——用一根色谱柱可分别不同的化合物。
样品量少,简单回收——样品经过色谱柱后不被破坏,能够采集单调组分或做制备。
三、色谱法分类
按两相的物理状态可分为:气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法合用于分别挥发性化合物。
GC依据固定相不同又可分为气固色谱法

(GSC)

随和液色谱法

(GLC),此中以

GLC应用最广。液相色谱法适
用于分别低挥发性或非挥发性、热稳固性差的物质。LC相同可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法

(LLC)。
其他还有超临界流体色谱法(SFC),它以超临界流体(界于气体和液体之间的一种物相)为流动相(常用CO2),因其扩散系数大,能很快达到均衡,故剖析时间短,特别合用于手性化合物的拆分。
按原理分为吸附色谱法(AC)、分派色谱法(DC)、离子互换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC,又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶浸透色谱法(GPC)和亲和色谱法。(其他还有电泳。)
按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。
四、色谱分别原理
高效液相色谱法按分别体制的不同分为液固吸附色谱法、液液分派色谱法(正相与反相)、离子互换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
,被分别组分在色谱柱上分别原理是依据固定相对组分吸附力大小不
同而分别。分别过程是一个吸附-解吸附的均衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝,粒度5~10μm。合用
于分别分子量200~1000的组分,大多半用于非离子型化合物,离子型化合物易产生拖尾。常用于分别同分
异构体。
,或化学键合于担体表面而形成的固定相,
原理是依据被分其他组分在流动相和固定相中溶解度不同而分别。分别过程是一个分派均衡过程。

分别
涂布式固定相应拥有优异的惰性;流动相一定早先用固定相饱和,以减少固定相从担体表面流失;温度的变化和不同批号流动相的差异常惹起柱子的变化;此外在流动相中存在的固定相也使样品的分别和采集复杂化。因为涂布式固定相很难防止固定液流失,此刻已极少采纳。此刻多采纳的是化学键合固定相,如C18、C8、氨基柱、***基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。
正相色谱法采纳极性固定相(如聚乙二醇、氨基与***基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷),常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三***甲烷等以调理组分的保存时间。常用于分别中等极性和极性较强的化合物(如酚类、***类、羰基类及氨基酸类等)。
反相色谱法
一般用非极性固定相(如C18、C8);流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙***、异丙醇、
***、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调理保存时间。合用于分别非极性和极性较弱的化合物。
RPC在
现代液相色谱中应用最为宽泛,据统计,它占整个
HPLC应用的80%左右。
跟着柱填料的快速发展,反相色谱法的应用范围渐渐扩大,现已应用于某些无机样品或易解离样品的
剖析。为控制样品在剖析过程的解离,常用缓冲液控制流动相的
pH值。但需要注意的是,
C18和C8使用的
pH值往常为~(2~8),太高的pH值会使硅胶溶解,太低的
pH值会使键合的烷基零落。有报告新商品柱
可在pH~10范围操作。
正相色谱法与反相色谱法比较表
正相色谱法
反相色谱法
固定相极性
高~中
中~低
流动相极性
低~中
中~高
组分洗脱序次
极性小先洗出
极性大先洗出
从上表可看出,当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有显然的界限(如氨基键合固定相)。
,常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架,在表面未
端芳环上接上羧基、磺酸基(称阳离子互换树脂)或季氨基(阴离子互换树脂)。被分别组分在色谱柱上
分别原理是树脂上可电离离子与流动相中拥有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆互换,依据各离子与离子互换基团拥有不同的电荷吸引力而分别。
缓冲液常用作离子互换色谱的流动相。被分别组分在离子互换柱中的保存时间除跟组分别子与树脂上
的离子互换基团作用强弱有关外,它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度,从而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大,则离子强度高,不利于样品的解离,致使样品较快流出。
离子互换色谱法主要用于剖析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
,是液液色谱法的分支。它是依据被测组分别子与离子对试剂离
子形成中性的离子对化合物后,在非极性固定相中溶解度增大,从而使其分别成效改良。主要用于剖析离子强度大的酸碱物质。
剖析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐,如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。此外高***酸、三***乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。
剖析酸性物质常用四丁基季铵盐,如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。
离子对色谱法常用ODS柱(即C18),流动相为甲醇-水或乙***-水,水中加入3~10mmol/L
剂,在必定的pH值范围内进行分别。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相构成及其
强度有关。

的离子对试
pH值、离子


固定相是有必定孔径的多孔性填料,

流动相是能够溶解样品的溶剂。

小分子量的化合
物能够进入孔中,滞留时间长;大分子量的化合物不可以进入孔中,直接随流动相流出。它利用分子筛对分
子量大小不同的各组分排阻能力的差异而达成分别。常用于分别高分子化合物,如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

一、基本观点和术语

色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器,所获取的信号-时间曲线,又称色谱流出曲线(elutionprofile)。
基线(baseline)——经流动相冲刷,柱与流动相达到均衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
噪音(noise)——基线信号的颠簸。往常因电源接触不良或刹时过载、检测器不稳固、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
漂移(drift)——基线随时间的慢慢变化。主要因为操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳固所惹起,柱内的污染物或固定相不停被洗脱下来也会产生漂移。
色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的崛起部分。正常
色谱峰近似于对称形正态散布曲线(高斯Gauss曲线)。不对称色谱峰有两种:前延峰(leadingpeak)
和拖尾峰(tailingpeak)。前者少见。
拖尾因子(tailingfactor,T)——T=,用以权衡色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetryfactor)
或不对称因子(asymmetryfactor)。《中国药典》规定T应为~。T<为前延峰,T>为拖尾峰。
峰底——基线上峰的起点至终点的距离。
峰高(peakheight,h)——峰的最高点至峰底的距离。
峰宽(peakwidth,W)——峰双侧拐点地方作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ
半峰宽(peakwidthathalf-height,Wh/2)——峰高一半处的峰宽。Wh/2=σ
标准偏差(standarddeviation,σ)——正态散布曲线x=±1时(拐点)的峰宽之半。正常峰的拐
点在峰高的倍处。标准偏差的大小说明组分在流优异谱柱过程中的分别程度。σ小,分别程度小、极
点浓度高、峰形瘦、柱效高;反之,σ大,峰形胖、柱效低。
峰面积(peakarea,A)——峰与峰底所包围的面积。A=×σ×h=σh=Wh/2h
(保存值)
死时间(deadtime,t0)——不保存组分的保存时间。即流动相(溶剂)经过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
死体积(deadvolume,V0)——由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占有的空间。它包
括4部分:进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒空隙(被流动相占有,
Vm)、柱出口管路体
积、检测器流动池体积。此中只有
Vm参加色谱均衡过程,其余
3部分只起峰扩展作用。为防备峰扩
展,这3部分体积应尽量减小。
V0=F×t(0F为流速)
保存时间(retentiontime,tR)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
保存体积(retentionvolume
,VR)——从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的
体积。又称洗脱体积。VR=F×tR
调整保存时间(adjustedretentiontime,t'R)——扣除死时间后的保存时间。也称折合保存时间
(reducedretentiontime)。在实验条件(温度、固定相等)一准时,
t'R只决定于组分的性质,所以,
t'R(或tR)可用于定性。t'R=tR-t0
调整保存体积(adjustedretentionvolume,V'R)——扣除死体积后的保存体积。
V'R=VR-V0或V'R
=F×t'R

理论塔板数(theoreticalplatenumber,N)——用于定量表示色谱柱的分别效率(简称柱效)。
取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径散布等)、填补状况、柱长、流动相的种类和流速及测定
柱效所用物质的性质。假如峰形对称并切合正态散布,
N可近似表示为:
2
2
2
N=( )
=16( )
=( )
N为常量时,W随tR成正比率变化。在一张多组分色谱图上,假如各组分含量相当,则后洗脱的峰比前面的峰要渐渐加宽,峰高则渐渐降低。
用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用,因为半峰宽更易正确测定,特别是对稍有拖尾
的峰。
N与柱长成正比,柱越长,

N越大。用

N表示柱效时应注明柱长,假如未注明,则表示柱长为

1米时
的理论塔板数。(一般

HPLC柱的

N在1000以上。)
若用调整保存时间

(t'R)计算理论塔板数,所得值称为有效理论塔板数

(N

有效或Neff)。
理论塔板高度(theoreticalplateheight,H)——每单位柱长的方差。
H=。实质应用时常常用柱长
L和理论塔板数计算:H=,H有效=。

分派系数(distributioncoefficient,K)——在必定温度下,化合物在两相间达到分派均衡时,在固定相与流动相中的浓度之比。K=。
分派系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关,也与温度、压力有关。在不同的色谱分别体制
中,K有不同的观点:吸附色谱法为吸附系数,离子互换色谱法为选择性系数(或称互换系数),凝胶
色谱法为浸透参数。但一般状况可用分派系数来表示。
在条件(流动相、固定相、温度和压力等)必定,样品浓度很低时(

Cs、Cm很小)时,

K只取决于组
分的性质,而与浓度没关。这不过理想状态下的色谱条件,在这种条件下,获取的色谱峰为正常峰;在很多状况下,跟着浓度的增大,K减小,这时色谱峰为拖尾峰;而有时跟着溶质浓度增大,K也增大,这时色谱峰为前延峰。所以,只有尽可能减少进样量,使组分在柱内浓度降低,K恒准时,才能获取正常峰。
在同一色谱条件下,样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长,后流优异谱柱;K值小的组分则滞留时间短,先流优异谱柱。混淆物中各组分的分派系数相差越大,越简单分别,所以混淆物中各组分的分派系数不同是色谱分其他前提。
在HPLC中,固定相确立后,K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的构成配比及

pH
值,以获取组分间的分派系数差异及适合的保存时间,达到分其他目的。
容量因子(capacityfactor,k)——化合物在两相间达到分派均衡时,在固定相与流动相中的量之比。k=。所以容量因子也称质量分派系数。
分派系数、容量因子与保存时间之间有以下关系:k===K=,t'R=kt0。上式说明容量因子的物理意
义:表示一个组分在固定相中逗留的时间(t'R)是不保存组分保存时间(t0)的几倍。k=0时,化合物全
部存在于流动相中,在固定相中不保存,t'R=0;k越大,说明固定相对此组分的容量越大,出柱慢,保存
时间越长。
容量因子与分派系数的不同点是:
关;k除了与性质及温度有关外,还与

K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度,而与体积Vs、Vm无
Vs、Vm有关。因为t'R、t0较Vs、Vm易于测定,所以容量因子比分派
系数应用更宽泛。
选择性因子(selectivityfactor,α)——相邻两组分的分派系数或容量因子之比。
>k1)。因k=t'R/t0,则α=,所以α又称为相对保存时间(《美国药典》)。

α==

(设

k2
要使两组分获取分别,一定使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分派性质、柱温有关,与柱尺
寸、流速、填补状况没关。从实质上来说,α的大小表示两组分在两相间的均衡分派热力学性质的差异,即分子间互相作使劲的差异。

分别度(resolution,R)——相邻两峰的保存时间之差与均匀峰宽的比值。也叫分辨率,表示相邻两峰的分别程度。R=。当W1=W2时,R=。当R=1时,称为4σ分别,两峰基安分别,裸露峰面
积为%,内侧峰基重叠约2%。R=时,称为6σ分别,裸露峰面积为%。R≥称为完整分别。《中国药典》规定R应大于。
基安分别方程——分别度与三个色谱基本参数有以下关系:
R=××
此中称为柱效项,为柱选择性项,为柱容量项。柱效项与色谱过程动力学特征有关,后两项与色谱过程热力学要素有关。
从基安分别方程可看出,提升分别度有三种门路:①增添塔板数。方法之一是增添柱长,但这样会延
长保存时间、增添柱压。更好的方法是降低塔板高度,提升柱效。②增添选择性。当α=1时,R=0,不论
柱效有多高,组分也不行能分别。一般能够采纳以下举措来改变选择性:;
改变柱温;。③改变容量因子。这常常是提升分别度的最简单方法,能够经过调理流动相
的构成来实现。k2趋于0时,R也趋于0;k2增大,R也增大。但k2不可以太大,不然不只分别时间延伸,而
且峰形变宽,会影响分别度和检测敏捷度。一般k2在1~10范围内,最好为2~5,窄径柱可更小些。
二、塔板理论

塔板理论是Martin和Synger第一提出的色谱热力学均衡理论。它把色谱柱看作分馏塔,把组分在色谱柱内的分别过程当作在分馏塔中的分馏过程,即组分在塔板间隔内的分派均衡过程。塔板理论的基本假定
为:
1)色谱柱内存在很多塔板,组分在塔板间隔(即塔板高度)内完整听从分派定律,并很快达到分派均衡。
2)样品加在第0号塔板上,样品沿色谱柱轴方向的扩散能够忽视。
3)流动相在色谱柱内间歇式流动,每次进入一个塔板体积。
4)在所有塔板上分派系数相等,与组分的量没关。
固然以上假定与实质色谱过程不符,如色谱过程是一个动向过程,很难达到分派均衡;组分沿色谱柱轴方向的扩散是不行防止的。可是塔板理论导出了色谱流出曲线方程,成功地解说了流出曲线的形状、浓度极大点的地点,能够评论色谱柱柱效。
(峰高h和峰面积A)
依据塔板理论,流出曲线可用下述正态散布方程来描绘:
C=e

或

C=e
由色谱流出曲线方程可知:当t=tR时,浓度C有极大值,Cmax=。Cmax就是色谱峰的峰高。所以上式
说明:①当实验条件一准时(即σ必定),峰高h与组分的量C0(进样量)成正比,所以正常峰的峰高可
用于定量剖析。②当进样量一准时,σ越小(柱效越高),峰高越高,所以提升柱效能提升HPLC剖析的灵
敏度。
由流出曲线方程对V(0~∞)求积分,即得优异谱峰面积A=×σ×Cmax=C0。可见A相当于组分进样量
C0,所以是常用的定量参数。
把Cmax=h和Wh/2=σ代入上式,即得
A=×Wh/2×h,此为正常峰的峰面积计
算公式。
三、速率理论(又称随机模型理论)

1956年荷兰学者VanDeemter等人汲取了塔板理论的观点,并把影响塔板高度的动力学要素联合起来,
提出了色谱过程的动力学理论——速率理论。它把色谱过程看作一个动向非均衡过程,研究过程中的动力学要素对峰展宽(即柱效)的影响。
以后Giddings和Snyder等人在VanDeemter方程(H=A+B/u+Cu,后称气相色谱速率方程)的基础
上,依据液体与气体的性质差异,提出了液相色谱速率方程(即Giddings方程):
H=2λdp++\s\up5(2p+\s\up5(2p+\s\up5(2f

1)涡流扩散(eddydiffusion)。因为色谱柱内填补剂的几何结构不同,分子在色谱柱中的流速不同而
惹起的峰展宽。涡流扩散项A=2λdp,dp为填料直径,λ为填补不规则因子,填补越不均匀λ越大。HPLC
常用填料粒度一般为3~10μm,最好3~5μm,粒度散布RSD≤5%。但粒度太小难于填补均匀(λ大),且会
使柱压过高。大而均匀(球形或近球形)的颗粒简单填补规则均匀,λ越小。总的说来,应采纳细而均匀
的载体,这样有助于提升柱效。毛细管无填料,A=0。
2)分子扩散(moleculardiffusion)。又称纵向扩散。因为进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度,致使
轴向扩散而惹起的峰展宽。分子扩散项
B/u=2γDm/u。u为流动相线速度,分子在柱内的滞留时间越长(u
小),展宽越严重。在低流速时,它对峰形的影响较大。
Dm为分子在流动相中的扩散系数,因为液相的
Dm很小,往常仅为气相的
10-4~10-5,所以在HPLC中,只需流速不太低的话,这一项能够忽视不计。γ是考
虑到填料的存在使溶质分子不可以自由地轴向扩散,
而引入的柱参数,用以对Dm进行校订。γ一般在~左右,
毛细管柱的γ=1。
3)传质阻抗(masstransferresistance)。因为溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传质过程
而致使的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分派、转移的过程其实不是瞬时达到均衡,实质传质速度是有限的,这一时间上的滞后使色谱柱老是在非均衡状态下工作,从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。
①流动相传质阻抗Hm=Cmd2pu/Dm,Cm为常数。这是因为在一个流路中流路中心和边沿的流速不等所
致。凑近填补颗粒的流动相流速较慢,而中心较快,处于中心的分子还将来得及与固定相达到分派均衡就随流动相前移,因此产生峰展宽。
②静态流动相传质阻抗Hsm=Csmd2pu/Dm,Csm为常数。这是因为溶质分子进入处于固定相孔穴内的静
止流动相中,晚回到流路中而惹起峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的
颗粒越小,微孔孔径越大,传质阻力就越小,传质速率越高。所以改良固定相结构,减小静态流动相传质
阻力,是提升液相色谱柱效的重点。
Hm和Hsm都与固定相的粒径平方d2p成正比,与扩散系数Dm成反比。所以应采纳低粒度固定相和低
粘度流动相。高柱温能够增大Dm,但用有机溶剂作流动相时,易产生气泡,所以一般采纳室温。③固定相传质阻抗Hs=Csd2fu/Ds(液液分派色谱),Cs为常数,df为固定液的液膜厚度,Ds为分子在
固定液中的扩散系数。在分派色谱中Hs与df的平方成正比,在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。
所以只有在厚涂层固定液、深孔离子互换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中,Hs才有显然影响。采纳单分子
层的化学键合固定相时Hs能够忽视。
VR/。其次,希望将样品直接进在柱头的
赶快率方程式能够看出,要获取高效能的色谱剖析,一般可采纳以下举措:①进样时间要短。②填料
粒度要小。③改良传质过程。过高的吸附作使劲可致使严重的峰展宽和拖尾,甚至不行逆吸附。④适合的
流速。以H对u作图,则有一最正确线速度uopt,在此线速度时,H最小。一般在液相色谱中,uopt很小(大
约~),在这样的线速度下剖析样品需要很长时间,一般来说都选在

1mm/s

的条件下操作。⑤较小
的检测器死体积。

速率理论研究的是柱内峰展宽要素,实质在柱外还存在惹起峰展宽的要素,即

柱外效应(色谱峰在柱
外死空间里的扩展效应)。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和,即:
σ2=σ2柱内+σ2柱外+σ2其余
柱外效应主要由劣质的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子自己之外的所有死体积所惹起。为了减少柱外效应,第一应尽可能减少柱外死体积,如使用“零死体积接头”连结各零件,管道对接宜呈流线
形,检测器的内腔体积应尽可能小。研究表示柱外死体积之和应<
中心部位,可是因为进样阀与柱间有接头,柱外效应老是存在的。其他,要求进样体积≤
VR/2。
柱外效应的直观标记是容量因子
k小的组分(如k<2)峰形拖尾和峰宽增添得更为显然;
k大的组分
影响不显着。因为HPLC的特别条件,当柱子自己效率越高(
N越大),柱尺寸越小时,柱外效应越显得突
出。而在经典LC中则影响相对较小。

HPLC系一致般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及办理装置等构成。此中输液泵、色谱柱、检测器是重点零件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控
制器等,现代HPLC仪还有微机控制系统,进行自动化仪器控制和数据办理。制备型HPLC仪还备有自动馏分采集装置。
最早的液相色谱仪由粗拙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、画图仪,绘出的峰是经过手工丈量计算峰面积。以后的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱,柱填料从单调品种发展至几百种种类,检测器从单波长至可变波长检测器、可得三维色谱图的二极管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器。数据办理不再用画图仪,渐渐取而代之的是最简单的积分仪、计算机、工作站及网络办理系统。
目前常有的HPLC仪生产厂家外国有Waters企业、Agilent企业(原HP企业)、岛津企业等,国内有大连依利特企业、上海剖析仪器厂、北京剖析仪器厂等。
一、输液泵

输液泵是HPLC系统中最重要的零件之一。泵的性能利害直接影响到整个系统的质量和剖析结果的靠谱
性。输液泵应具备以下性能:①流量稳固,其RSD应<%,这对定性定量的正确性至关重要;②流量范围
宽,剖析型应在~10ml/min范围内连续可调,制备型应能达到100ml/min;③输出压力高,一般应能达到
150~300kg/cm2;④液缸容积小;⑤密封性能好,耐腐化。
泵的种类好多,按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞来去泵
和隔阂来去泵。恒压泵受柱阻影响,流量不稳固;螺旋泵缸体太大,这两种泵已被裁减。目前应用最多的
是柱塞来去泵。
柱塞来去泵的液缸容积小,可至,所以易于冲洗和改换流动相,特别适合于再循环和梯度洗脱;改变
电机转速能方便地调理流量,流量不受柱阻影响;泵压可达400kg/cm2。其主要弊端是输出的脉冲性较大,
现多采纳双泵系统来战胜。双泵按连结方式可分为并联式和串连式,一般说来并联泵的流量重现性较好(RSD
为%左右,串连泵为~%),但出故障的时机许多(因多一单向阀),价钱也较贵。
各品牌输液泵的基本参数:
项目
Waters515型
HP1100型
LC-10ATvp型
EliteP200II型
检定要求
流速范围
~10
~10
~
~
调理精度
流量精细度
RSD%
%(<%)
%
%
%
流量正确度
±%
±%
±%
最高压力4000Psi40MPaMPaMPa
密封圈寿命
流动相的脉冲

为了延伸泵的使用寿命和保持其输液的稳固性,一定依照以下注意事项进行操作:
①防备任何固体微粒进入泵体,因为灰尘或其余任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀,所以应早先除掉流动相中的任何固体微粒。流动相最幸亏玻璃容器内蒸馏,而常用的方法是滤过,可采纳Millipore滤膜(μm或μm)等滤器。泵的进口都应连结砂滤棒(或片)。输液泵的滤器应常常冲洗或改换。
②流动相不该含有任何腐化性物质,含有缓冲液的流动相不该保存在泵内,特别是在停泵留宿或更长时间的状况下。假如将含缓冲液的流动相留在泵内,因为蒸发或泄露,甚至不过因为溶液的静置,便可能析出盐的微细晶体,这些晶体将和上述固体微粒相同破坏密封环和柱塞等。所以,一定泵入纯水将泵充分
冲洗后,再换成适合于色谱柱保存和有益于泵保护的溶剂(关于反相键合硅胶固定相,能够是甲醇或甲醇-水)。
③泵工作时要留意防备溶剂瓶内的流动相被用完,不然空泵运行也会磨损柱塞、缸体或密封环,最后产生漏液。