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·2917·
·论著·
整联蛋白通过介导表达影响基底细胞癌的
α51Gli1
β生长与放疗敏感性*
李锦意,黄小辉,范国雄
广东省惠州市第三人民医院皮肤科,广东惠州
516000
摘要:目的探讨整联蛋白对基底细胞癌()生长和放疗敏感性的影响及分子机制。方法采
α51BCC
用免疫组织化学染色检测皮肤组β织及正常皮肤组织中的表达差异。将细胞随机分为对照
BCCα51A431A
组(细胞正常培养)、组(采用含的慢病β毒转染细胞)、组(采用含
pLEX-MCSpLEX-MCSpLEX-α51pLEX-α51
的慢病毒转染细胞)、家族锌指蛋白()抑制剂组(采用含β的慢病毒转染细胞β,
pLEX-α51+Gli1Gli1pLEX-α51
并添加/抑制β剂处理细胞)。采用实时荧光定量和蛋白质β免疫印迹法检测细胞
100molLGli1GANT61PCR
内与μ的表达情况;采用法和乙炔基脱氧尿苷()染色检测细胞增殖能力;通过
α51Gli1MTT5--2'-EdUHo-
β染色观察细胞凋亡形态;采用实验检测细胞的迁移与侵袭能力。再将细胞随机分
echst33258TranswellA431
为对照组(细胞正常培养)、组(采用射线照射细胞)、组(采用含
B4Gy4GyXpLEX-α51+4GypLEX-α51
的慢病毒转染细胞,再用射线照射细胞),采用法检测细胞增殖活β性,流式细胞术检测细胞凋亡β情
4GyXMTT
况。结果在皮肤组织中的阳性表达率高于正常皮肤组织(P)。与对照组和
α51BCC<-MCS
组比较,β组细胞中和和蛋白表达水平均升高,细胞存活率升高,阳性细胞率
pLEX-α5β1α5β1Gli1mRNAEdU
升高,迁移细胞数与侵袭细胞数均增加,差异有统计学意义(P)。与组比较,
<-α51pLEX-α51+
抑制剂组细胞中和蛋白表达水平均下降,细胞存活率降低,阳β性细胞率降低,迁移β细胞
Gli1Gli1mRNAEdU
数与侵袭细胞数也均减少,差异有统计学意义(P)。在处理后培养、和时,与对照组比较,
<
组细胞增殖活性明显降低(P);组细胞增殖活性较组明显升高(P
4Gy<-α5β1+4Gy4Gy<
)。组细胞凋亡率较对照组明显升高(P);组细胞凋亡率较组明显
<-α5β1+4Gy4Gy
降低(P)。结论在组织中高表达,能够促进细胞增殖、迁移及侵袭,抑制细胞凋亡,并
<
降低细胞的放疗敏感性,该作β用可能与调控表达有关。
Gli1
关键词:基底细胞癌;;家族锌指蛋白;放疗敏感性
α5β1Gli1
DOI中图法分类号:
:.1673-
文章编号:()文献标志码:
1673-4130202223-2917-08A
Integrinαβaffectsthegrowthandradiosensitivityofbasalcellcarcinomaby
51
mediatingtheexpressionofGli*
1
LIJinyi,HUANGXiaohui,FANGuoxiong
DepartmentofDermatology,ThirdPeople'sHospitalofHuizhou,Huizhou,Guangdong,China
516000
Abstract:Objective
Toexploretheeffectofintegrinα5β1onthegrowthandradiosensitivityofbasalcell
()Methods


(β),(),
groupAcellswithnormalculturepLEX-MCSgrouptransfectedcellswithpLEX-MCSlentiviruspLEX-
(),()
α51grouptransfectedcellswithpLEX-α51lentiviruspLEX-α51+Glifamilyzincfingerprotein1Gli1
β(ββ/
inhibitorgroupcellsweretransfectedwithpLEX-α51lentivirusandtreatedwith100molLGli1inhibitor
)βμ
-timefluorescentquantitativePCR
β()
-ethynyl-2'-deoxyuridineEdUstainingwereusedtodetectcellprolifer-
-

(),(),
Bcellswithnormalculture4Gygroupcellswereirradiatedwith4GyX-raypLEX-α51+4Gygroup
()β
cellsweretransfectedwithpLEX-α5β1lentivirusandirradiatedwith4GyX-
,Results
-
基金项目吴阶平医学基金会临床科研专项资助基金项目
*:(-01-08)。
作者简介李锦意女医师主要从事皮肤肿瘤银屑病的临床研究
:,,,、。
国际检验医学杂志年月第卷第期,,,
·2918·
(P)
sionrateofα51inskinBCCtissueswashigherthanthatinnormalskintissues<
β,
controlgroupAandpLEX-MCSgroupthemRNAandproteinexpressionlevelsofα51andGli1inpLEX-
,,β,
α51groupwereincreasedthecellsurvivalratewasincreasedtherateofEdUpositivecellswasincreased
β,
andthenumberofmigratingcellsandinvadingcellswereincreasedandthedifferenceswerestatisticallysig-
(P),
nificant<-α51grouptheexpressionlevelsofGli1mRNAandproteinin
β,,
thepLEX-α51+Gli1inhibitorgroupweredecreasedthecellsurvivalratewasdecreasedtherateofEdUpos-
β,,
itivecellswasdecreasedthenumberofmigratingcellsandinvadingcellswerealsodecreasedandthediffer-
(P),,
enceswerestatisticallysignificant<
(P),
activityofcellsin4GygroupwassignificantlylowerthanthatincontrolgroupB<
(P)
activityofcellsinpLEX-α5β1+4Gygroupwassignificantlyhigherthanthatin4Gygroup<
(P)
apoptosisrateofcellsin4GygroupwassignificantlyhigherthanthatincontrolgroupB<-
(P)
optosisrateofcellsinpLEX-α5β1+4Gygroupwassignificantlylowerthanthatin4Gygroup<.
Conclusion,,
α51ishighlyexpressedinBCCtissueswhichcanpromotetheproliferationmigrationandinva-
β,,,
sionofBCCcellsinhibitcellapoptosisandreducetheradiosensitivityofcellswhichmayberelatedtothe
regulationofGli1expression.
Keywords:;;;
basalcellcarcinomaα5β1Glifamilyzincfingerprotein1radiosensitivity
基底细胞癌起源于表皮的最内层或毛囊本来源患者中男例女例年龄岁平
(BCC)17,15;40~68,
外根鞘属于源自基底细胞的常见恶性上皮肿瘤之均岁所有患者术前均未经放疗光
,(±)。、
一[1-2]性别年龄紫外线辐射情况吸烟史等都是动力及其他手段治疗并已排除合并其他类型肿瘤
。、、、,。
形成的影响因素[3]起病较为隐匿因而易所有患者对本研究知情同意并签署知情同意书
BCC。BCC,,。
发生漏诊其治疗后复发也极为常见目前药物和12仪器与试剂细胞购于中国科学院基础
,。,.A431
手术治疗的效果欠佳[4]放疗在手术耐受能力医学研究所抑制剂购于英国
BCC。,Gli1GANT61Abcam
差且年龄较大的患者中被广泛使用然而随着公司胎牛血清培养基和胰蛋白酶购于美国
BCC,,,、DMEM
肿瘤细胞对放疗抵抗性的产生需要增大照射剂量公司免疫组织化学染色试剂盒购于江苏凯基
,,Gibco,
但这一操作将会对正常组织造成严重损伤整联蛋生物有限公司试剂盒反转录试剂盒
。,RNAisoPlus、
白又称为整合素是一类黏附分子属于异源二聚体和实时荧光定量试剂盒购于日本公
,,PCRTaKaRa
跨膜糖蛋白可介导细胞细胞和细胞细胞环境之间司二氨基联苯***显色试剂盒二脒基
,--,(DAB)、4',6--2-
的相互作用在多种类型的细胞中广泛表达主要包苯基吲哚染料二喹啉甲酸蛋白测定
,,(DAPI)、(BCA)
括肿瘤细胞内皮细胞成纤维细胞和免疫细胞等[5]试剂盒和增强化学发光法发光液购于碧云天
、、。(ECL)
整联蛋白作为整联蛋白家族的重要成员之一生物技术研究所聚偏***乙烯膜和
α5β1,,(PVDF)Transwell
由和亚基的二聚化形成已知其在多种肿瘤中小室购于美国公司试剂盒乙炔基脱
1α5,BD,MTT、5--2'-
高表β达并参与调控肿瘤细胞生长黏附侵袭迁移氧尿苷细胞增殖检测试剂盒及
,、、、(EdU)Hoechst33258
及肿瘤血管生成[6-7]家族锌指蛋白是细胞凋亡染色试剂盒购于上海贝博生物科技有限公
。Gli1(Gli1)
信号通路远端的效应转录因子司细胞凋亡检测试剂盒购于北
Hedgehog(Hh),Hh,AnnexinV-FITC/PI
信号通路是多种生物学过程的重要介质包括胚胎发京百奥莱博科技有限公司兔抗多克隆抗体兔
,,α5β1、
生成体组织稳态及肿瘤发生发展研究表明抗多克隆抗体鼠抗磷酸甘油醛脱氢酶
、、。,Gli1Gli1、3-(GAP-
的异常激活与多种恶性肿瘤的发生有关例如乳腺癌单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记二抗
,、DH)(HRP)
结肠癌肝细胞癌及子宫内膜癌的发生等[8-9]基于此购于英国公司重组慢病毒载体
、。,Abcam。pLEX-MCS
本研究检测了在中的表达情况并探究其对与的构建包装及滴度测定均由丰晖生物
α5β1BCC,pLEX-α51、
肿瘤细胞生长与放疗敏感性的影响及相关分子机制旨科技有限公β司完成其他实验试剂均为国产分析纯
,。。
在为以为靶点的治疗提供实验依据型细胞培养箱购于美国
α5β1BCC。BB150-2TCSThermoFisher
1资料与方法公司型光学显微镜购于日本
Scientific,CX43Olym-
11一般资料选取年月至年月本公司型激光共聚焦显微镜购于日本
.2020620216pus,C1SiNikon
院皮肤科门诊收治的例患者的皮肤组公司型线深部治疗机购于丹东市康
32BBCBBC,XSZ-220/20X
织标本为研究对象标本来源患者均经临床和病理检佳医用机厂型酶标仪购于美国公司
,,iMarkBio-Rad,
查确诊其中男例女例年龄岁平均型电泳系统购于北京六一仪器厂
,20,12;38~69,DYY-16D,FACS-
岁以同期例行非肿瘤性皮瓣移型流式细胞仪购于美国公司
(±)。32CantoⅡBD。
植手术患者的正常皮肤组织标本作为对照对照标13方法
。.
国际检验医学杂志年月第卷第期,,,
·2919·
131免疫组织化学染色将皮肤组织及正白表达水平
..BBC。
常皮肤组织标本在多聚甲醛中固定石蜡包埋制135法收集转染后的细胞每孔中
4%,,..MTTA431,
成厚的切片切片脱蜡加入柠檬酸缓冲液煮加入混匀继续培养再加入
4m。,20LMTT,4h,200L
沸在μ溶液中消除内源性过氧化物酶山羊二***亚μ砜摇床振荡至结晶物完全溶解μ
22
,3%HO,(DMSO),,
血清室温封闭滴加兔抗多克隆抗体酶标仪检测处各孔的吸光度值计算各
。α51490nm(A),
孵育过夜磷酸盐缓β冲液清洗组细胞存活率各组值对照孔值
(1∶200),4℃。(PBS),=A/A×100%。
滴加标记二抗室温孵育136染色收集转染后的细胞调整
HRP(1∶1000),30min,..EdUA431,
显色苏木素复染反复冲洗脱水透明中性树水平后以5个孔接种于孔板加入
DAB,,,,1×10/24,10
胶封片干燥通过光学显微镜观察染色情况并摄取进行染色处理清洗再用
,。mol/LEdU,PBS,Apol-
图片阳性表达多呈棕黄色至棕褐色随机选择μ避光孵育染料染核洗涤后封
,α51,lo56730min,DAPI,
个视野β结果根据阳性细胞率与染色强度进行综合片干燥通过激光共聚焦显微镜观察细胞染色情况
5,,,
评定阳性细胞率评分记分记并摄取图片红色荧光为阳性细胞的细胞核随
。:<5%0,5%~25%1,EdU,
分记分记分机选择个视野计数该视野下阳性细胞数与
,>25%~50%2,>50%~75%3,>5,EdU
记分染色强度评分未着色记分黄色记总细胞数两者比值为阳性细胞率
75%4。:0,1,EdU。
分棕黄色记分棕褐色记分两者分数相加137染色收集转染后的细
,2,3。<2..Hoechst33258A431
分为阴性分为阳性胞清洗多聚甲醛固定加入
,≥2。,PBS,4%,200μLHo-
132细胞培养与转染取细胞随机分为对染色液室温避光孵育再次
..A431echst33258,10min,PBS
照组组组清洗滴加抗荧光猝灭剂封片干燥通过荧光显微镜
A、pLEX-MCS、pLEX-α51、pLEX-α51+,,,
抑制剂组在各组细胞β中添加含β胎观察各组细胞凋亡情况并摄取图片细胞核呈蓝色
Gli1。A43110%,,
牛血清青链霉素的培养基置于荧光浓染颗粒为凋亡细胞
、1%-DMEM,37℃、。
培养箱中过夜培养调整细胞水平为138实验将胶铺于孔
2
5%CO。4×..TranswellMatrigel24
5取接种于孔板分别将含上室底部置于培养箱内凝胶将转
10/mL,100μL6,pLEX-Transwell,37℃。
和的慢病毒液加入对应组的细胞孔染后的细胞水平调整为4吸取
MCSpLEX-α51A4312×10/mL,200
内进行转染病β毒转染复数设为移入上室下室加入含胎
,(MOI)50∶1。μLTranswell,600μL10%
抑制剂组细胞在转染时添加牛血清的新鲜培养液培养后用多聚甲醛固
pLEX-α51+Gli1100,24h4%
β抑制剂转染培养收集定结晶紫染色清洗通过光学显微镜观
mol/LGli1GANT61。4h,,%,PBS,
μ细胞换用新鲜培养液添加嘌呤霉素进行筛察并拍摄图像随机选择个视野计数侵袭细胞数
,,1mg/L,5。
选获得稳定表达的细胞系细胞迁移检测时在上室不铺胶
,α5β1A431。TranswellMatrigel,
133实时荧光定量采用试剂其余步骤均与上述步骤相同
..PCRRNAisoPlus。
盒提取转染后的细胞总测定纯度139细胞分组与放疗处理取细胞随机分
A431RNA,RNA..A431
与浓度将反转录合成以为模为对照组组组对照
。RNAcDNA,cDNAB、4Gy、pLEX-α5β1+4Gy。B
板根据实时荧光定量试剂盒说明书进行扩增组细胞正常培养组细胞进行射线照射
,PCR,,4Gy4GyX,
反应条件个循环组细胞进行转染慢病
:95℃3min,1;95℃20s,60℃pLEX-α5β1+4GypLEX-α5β1
个循环以为内参基因毒处理后采用射线照射将细胞按照4
15s,72℃45s,45。β-actin,4GyX。5×10
采用-ΔΔCt法计算和的表达水平个孔接种于孔板采用射线照射射
2α51Gli1mRNA。/6,4GyX(6mV
上游引物β下线垂直照射剂量率为源皮距为
α51:5'-CATCTTGGCATGCGCTCCA-3',,200cGy/min,100
游β引物上在处理后培养时采用法检
:5'-GTCTTGGTGAACTCGGCACT-3';Gli1cm)。24、48、72hMTT
游引物下游引测各组细胞增殖活性值
:5'-GGACAACCGCCATCCAGACT-3',A。
物上游引物1310流式细胞术收集经放疗处理后的细
:5'-GCCAGGGACACCTCCA-3';-actin:..A431
β下游引物胞清洗胰酶消化离心后用将沉淀重悬于
5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',:5'-AAC,PBS,,PBS
染料结合缓冲液中调整细胞水平为
GCTTCACGAATTTGCGT-3'。100μL,1×
134蛋白质免疫印迹法收集转6取悬液移入干净离心管中加入
..(Westernblot)10/mL,100L,
染后的细胞使用裂解液提取细胞总蛋μ和涡旋混匀室温避
A431,RIPA5LAnnexinV-FITC5LPI,,
白法进行蛋白定量制备十二烷基硫酸光μ静置随后立即通过μ流式细胞仪测定细胞凋
,BCA。10%20min,
钠聚丙烯酰***凝胶在梳孔加入标本电泳分离蛋白亡情况
-,,,。
转膜封闭缓冲液洗膜加入一抗孵育过14统计学处理采用软件及
、,TBST,,4℃.
夜次日缓冲液再洗膜加入二抗室温孵育软件进行数据分析及绘图符合正态分布
,TBST,,。
发光液显色凝胶成像系统扫描成像采用的计量资料以xs表示多组间比较采用方差分析
2h,ECL,,±,,
软件分析目的蛋白蛋多组间两两比较采用t检验计数资料以例数或
Image-、Gli1LSD-;
国际检验医学杂志年月第卷第期,,,
·2920·
率表示组间比较采用χ2检验以P为差异意义P见图组细胞中
,。<(>),2A、2B。pLEX-α51
有统计学意义和蛋白表达水平均明显高于β对照组和
。Gli1mRNAA
2结果组P而与组比较
pLEX-MCS(<);pLEX-α5β1,
21皮肤组织及正常皮肤组织表达情况抑制剂组和蛋白表达
.BBCα5β1pLEX-α5β1+Gli1Gli1mRNA
比较相较于正常皮肤组织皮肤组织内有大水平均明显下降P见图
,BBC(<),2C、2D。
量区域染色呈棕黄色至棕褐色见图皮肤组
,1;BBC
织阳性表达率为明显高于正
%(27/32),
常皮β肤组织的阳性表达率差
α5β1[%(4/32)],
异有统计学意义P
(<)。
22各组细胞中与表达情况比
.A431α51Gli1
较与对照组和β组比较
,
ApLEX-MCSpLEX-α5β1注为正常皮肤组织为皮肤组织
组细胞中和蛋白表达水平均明显升高:A;BBBC。
α5β1mRNA图免疫组织化学染色检测皮肤组织及正常皮肤
P抑制剂组1BBC
(<);pLEX-α5β1+Gli1α5β1mRNA组织中的表达()
和蛋白表达水平与组比较差异无统计学α5β1×200
pLEX-α5β1,
注为实时荧光定量检测的各组细胞中表达水平比较为检测的各组细胞中蛋白条带
:APCRA431α5β1mRNA;BWesternblotA431α5β1
图及表达水平比较为实时荧光定量检测的各组细胞中表达水平比较为检测的各组细胞中
;CPCRA431Gli1mRNA;DWesternblotA431Gli1
蛋白条带图及表达水平比较与对照组比较*P与组比较#P与组比较△P
;A,<;pLEX-MCS,<;pLEX-α5β1,<。
图各组细胞中与表达情况比较
2A431α5β1Gli1
23各组细胞增殖能力比较法检测与对照组和组比较组
.A431MTTApLEX-MCS,pLEX-α5β1
结果显示与对照组和组比较阳性细胞率明显升高P与
,ApLEX-MCS,pLEX-EdU(<);pLEX-α5β1
组细胞存活率明显升高P与组比较抑制剂组阳性细胞率
α5β1(<);pLEX-,pLEX-α5β1+Gli1EdU
组比较抑制剂组细胞存活率明显降低P见图
α5β1,pLEX-α5β1+Gli1(<),3B、3C。
明显降低P见图染色结果显示24各组细胞凋亡形态检测结果
(<),3A。EdU,.A431Hoechst
国际检验医学杂志年月第卷第期,,,
·2921·
染色结果显示对照组和组细25各组细胞迁移与侵袭能力比较
33258,ApLEX--
胞内均出现较明显的细胞核浓缩可见深色荧光浓染实验结果显示与对照组和组比
,swell,ApLEX-MCS
颗粒偶见细胞核碎裂而组细胞内染色较组迁移细胞数与侵袭细胞数均明显增
,;pLEX-α5β1,pLEX-α5β1
均匀细胞核和细胞质未发生浓缩相较于加P而相较于组
,;pLEX-(<);pLEX-α51,pLEX-
组抑制剂组有细胞发生细胞抑制剂组迁移细胞数与侵β袭细胞数均明
α5β1,pLEX-α5β1+Gli1α5β1+Gli1
核浓缩现象呈深色荧光浓染见图显减少P见图
,,4。(<),5。
注为法检测的各组细胞存活率比较为各组细胞中阳性细胞率比较为染色检测各组细胞增殖活
:AMTTA431;BA431EdU;CEdUA431
性图与对照组比较*P与组比较#P与组比较△P
(×100);A,<;pLEX-MCS,<;pLEX-α5β1,<。
图各组细胞增殖能力检测结果
3A431
图染色下各组细胞凋亡形态()
4Hoechst33258A431×200
26细胞对放疗的敏感性法检测各组显降低P见图
.A431MTT(<),6。
细胞增殖活性变化结果显示在处理后培养表不同培养时间各组细胞增殖活性值
1A431A
A431,,
比较(xs)
和时与对照组比较组细胞增殖±
、,,
244872hB4Gy组别
活性明显降低P而组细24h48h72h
(<);LEX-α51+4G
pβy对照组
±±±
4Gy(<),1。
流式细胞术检测放疗处理后细胞凋亡情况结果显组***
±±±
,
示组细胞凋亡率较对照组明显升高组###
PpLEX-α51+±±±
,(β
4GyB<
组细胞凋亡率较组明注与对照组比较*P与组比较#P
);pLEX-α5β1+4Gy4Gy:B,<;4Gy,<。
国际检验医学杂志年月第卷第期,,,
·2922·
注为显微镜下各组迁移细胞与侵袭细胞图为各组迁移细胞数比较为各组侵袭细胞数比较与对照组比较*P与
:A(×100);B;C;A,<;
组比较#P与组比较△P
pLEX-MCS,<;pLEX-α5β1,<。
图实验检测各组细胞的迁移与侵袭能力
5TranswellA431
注为各组流式细胞术检测结果为各组细胞凋亡率比较与对照组比较*P与组比较#P
:A;B;B,<;4Gy,<。
图流式细胞术检测各组细胞凋亡情况
6A431
3讨论疗药物维莫德吉索尼德吉等在内的方法此外光
、。,
据报道全球的发病率在不断增加我国约动力治疗和基因治疗目前也被应用到的临床治
,BCC,BCC
的皮肤肿瘤为[2]的治疗方式可分为疗中或已开展了大量的实验研究[10]虽然大多数早
70%BCC。BCC。
局部治疗和全身治疗其中局部治疗包括手术治疗期属于低度恶性肿瘤只发生局部病变且易于
,、BCC,
冷冻疗法激光及药物治疗等全身治疗包括使用化治疗但晚期的治疗方法仍然十分有限目前
、,,BCC。,
国际检验医学杂志年月第卷第期,,,
·2923·
晚期包括转移性和局部难治性治疗射的敏感性这意味着的高表达可能影响了肿
BCC(BCCBCC),α51
难度大治疗后年复发率达且患者预后不佳瘤细胞对放疗的敏感性β本研究结果显示在
,520%,。。,α51
因此进一步探索的发病机制及与其发生相关细胞中高表达降低了细胞对射线β照射
,BCCA4314GyX
的潜在生物标志物并以此来寻找治疗的新型的敏感性因此靶向可能是提高肿瘤细胞放疗
,BCC,,α51
方案是目前临床研究的热点及重