蛇床子素调控circ 0084043 miR-338-3p对高糖诱导的心肌细胞损伤的影响.pdf

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20225449 HebeiMedicalJournal,2022,
.1002-
:··
蛇床子素调控对高糖
circ_0084043/miR-338-3p
诱导的心肌细胞损伤的影响
袁雯杨昕宇杨华

【摘要】目的探讨蛇床子素对高糖诱导的心肌细胞损伤的影响及其对分子轴的调
circ_0084043/miR-338-3p
控作用。方法采用高糖诱导心肌细胞建立细胞损伤模型(组),加入不同浓度的蛇床子素处理细胞(
H9C2HGHG
蛇床子素低剂量组、蛇床子素中剂量组、蛇床子素高剂量组),将正常培养的细胞记为组;
+HG+HG+H9C2NCsi-
、分别转染入细胞后加入葡萄糖处理细胞(组、
NCsi-circ_0084043H9C230mmol/LHG+si-NCHG+si-circ_0084043
组),、分别转染入细胞后加入蛇床子素与葡萄糖处理细胞
pcDNApcDNA-circ_0084043H9C2100nmol/L30mmol/L
(蛇床子素高剂量组、蛇床子素高剂量组);采用法检测
HG++pcDNAHG++pcDNA-circ_0084043qRT-PCRcirc_
、的表达量;采用实验检测细胞活力;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;根据试剂盒检测
0084043miR-338-3pMTT
、的水平;双荧光素酶报告基因实验检测与的靶向关系;采用法检测
MDASODcirc_0084043miR-338-3pWesternblot
、蛋白表达量。结果与组比较,组的表达水平升高(P),的表达水
BaxBcl-2 NCHGcirc_0084043<-338-3p
平降低(P),细胞活力与蛋白水平和的活性降低(P),凋亡率与蛋白水平和的水平
<-2SOD<
升高(P);与组比较,蛇床子素不同剂量组的表达水平降低(P),的表达水
<<-338-3p
平升高(P),细胞活力与蛋白水平和的活性升高(P),凋亡率与蛋白水平和的水平
<-2SOD<
降低(P);可靶向调控;与组比较,组细胞活力与
<-338-3pHG+si-NCHG+si-circ_0084043Bcl-
蛋白水平和的活性升高(P),凋亡率与蛋白水平和的水平降低(P);与蛇床子素
2SOD<<+
高剂量组比较,蛇床子素高剂量组细胞活力与蛋白水平和的活性降
+pcDNAHG++pcDNA-circ_0084043Bcl-2SOD
低(P),凋亡率与蛋白水平和的水平升高(P)。结论蛇床子素可抑制的表达
<< circ_0084043
而促进的表达从而促进细胞增殖及抑制细胞凋亡、氧化应激进而减轻高糖诱导的心肌细胞损伤。
miR-338-3p
【关键词】蛇床子素;;;心肌细胞;增殖;凋亡;氧化应激
circ_0084043miR-338-3p
【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】()
R285 A 1002-7386202209-1307-05
Effectsofostholeoncardiomyocytedamageinducedbyhighglucoseanditsregulatoryeffectsoncirc/miR-
_0084043
-pmolecularaxisYUANWen∗,YANGXinyu,YANGHua∗,etal.∗TCMDepartment,LonghuaHospitalAffiliatedto
3383
ShanghaiTCMUniversity,Shanghai,China
200032
【Abstract】Objective
Toinvestigatetheefectsofostholeoncardiomyocytedamageinducedbyhighglucoseandits
Methods
regulatoryeffectsoncirc_0084043/miR-338-3pmolecularaxis. Highglucose-inducedcardiomyocyteH9C2was
(),(,
usedtoestablishacellinjurymodelHGgroupandthecellsweretreatedwithdifferentconcentrationsofosthollow
,),
-NCandsi-circ_0084043were
,(,),
transfectedintoH9C2cellsrespectively30mmol/Lglucose-treatedcellssi-NCgroupsi-circ_0084043groupwereadded
,
andpcDNAandpcDNA-circ_0084043wererespectivelytransfectedintoH9C2cellswhichweretreatedby100nmol/Losthole
(,)
and30mmol/Lglucoseostholehighdose+pcDNAgroupostholehighdose+pcDNA--PCR
,,
wasusedtodetecttheexpressionlevelsofcirc_0084043andmiR-338-3pandMTTdetectedthecellviabilityandflow
,

,
experimentwasusedtodetectthetargetingcorrelationbetweencirc_0084043andmiR-338-3pandWesternBlotwasusedto
Results,
detecttheexpressionlevelsofBaxandBcl-2protein. ComparedwiththoseinNCgrouptheexpressionlevelsofcirc
,(P),
_0084043andBaxproteinandtheMDAle3velsandtheapoptosisrateinHGgroupweresignificantlyincreased<
,
howevertheexpressionlevelsofmiR-338-3pandBcl-2proteinaswellastheactivityofSODweresignificantlydecreased
(P),
<
(P),,
indifferentdosesofostholegroupsweresignificantlydecreased<-338-3pand
(P)
Bcl-2aswellasthecellviabilityandtheactivityofSODweresignificantlyincreased<-
,,
NCgroupthecellviabilitytheproteinlevelofBcl-2andtheactivityofSODinsi-circ_0084043groupweresignificantly
(P),,(P
increased<<
)
+
作者单位上海市上海中医药大学附属龙华医院中医科,,
:200032 ,pcDNAgroupthecellviabilitytheproteinlevelof
袁雯杨华上海市普陀区中医医院中医外科杨昕宇
(、);()Bcl-2andtheactivityofSODinostholehighdose+
通讯作者杨昕宇
: E-mail:******@-circ_0084043groupweresignificantly
河北医药年月第卷第期
130820225449 HebeiMedicalJournal,2022,
(P),(P
decreased<<
)Conclusion,
. Ostholecaninhibittheexpressionofcirc_0084043soastopromotetheexpressionofmiR-338-3pto
,,
promotethecellproliferationandinhibitcellapoptosisoxidativestresstherebyrelievingthecardiomyocytedamageinducedby
highglucose.
【Keywords】;;;;;;
ostholecirc_0084043miR-338-3pcardiomyocytesproliferationapoptosisoxidativestress
糖尿病性心肌病属于糖尿病并发症之一是指糖培养记为正常糖组组细胞分别加
,24h,(NC)。H9C2
尿病引起的一种心肌病变可诱发心肌性坏死进而引入含有不同浓度
,(10nmol/L、33nmol/L、100nmol/L)
起心力衰竭心源性休克等最终造成患者死亡氧化应的蛇床子素与葡萄糖的培养基内培养
、,30mmol/L
激是促使糖尿病并发症发生的重要原因之一同时蛋分别记为蛇床子素低剂量组蛇床子
,24h,HG+、HG+
白与脂质过氧化等诱导的心肌细胞凋亡是造成糖尿病素中剂量组蛇床子素高剂量组
、HG+。si-NC、si-circ_
性心肌病的重要原因[1]已有研究报道指出部分中分别转染入细胞后加入含有
。0084043H9C230mmol/L
药具有抗炎抗氧化等作用还可促进高糖诱导的心肌葡萄糖的培养基内培养分别记为
、,24h,HG+si-NC
细胞生长及抑制炎性因子相关基因的表达[2]蛇床组组
。、HG+si-circ_0084043。pcDNA、pcDNA-circ_
子素是天然植物蛇床子萃取的单体其具有抗炎调节分别转染入细胞后加入含有
,、0084043H9C2100nmol/L
免疫等作用外还可抑制炎性反应而减轻大鼠心脏缺蛇床子素与葡萄糖的培养基内培养
,30mmol/L24h,
血再灌注损伤[3]但蛇床子素与糖尿病性心肌病相分别记为蛇床子素高剂量组蛇
。HG++pcDNA、HG+
关报道相对较少环状在糖尿病中表床子素高剂量组
。RNA(circRNA)+pcDNA-circ_0084043。
达异常并可能参与糖尿病并发症形成过程已有研究检测细胞中
,, qRT-PCRcirc_0084043、miR-338-
表明在糖尿病性视网膜病变中表达水平的表达水平根据试剂盒说明书提取各组
circ_00840433p:RNA
升高并可通过充当的海绵分子而促进糖细胞总检测浓度后置于冰箱
,miR-140-3pH9C2RNA,RNA-80℃
尿病性视网膜病变的发展[4]生物信息学分析显示内保存采用逆转录试剂盒将总逆转录为
。。RNA
与存在结合位点研究表明扩增反应体系
circ_0084043miR-338-3p,cDNA,PCR:SYBRGreenMasterMix
在高糖诱导的血管内皮细胞中表达水平正反向引物补足体
miR-338-3p10μl,,cDNA2μl,ddH2O
降低通过调控系至反应条件预变性变性
,circVEGFCmiR-338-3p/HIF-1α/20μl;:95℃2min,95℃
轴促进高糖诱导的血管内皮细胞凋亡[5]但退火延伸共次循环
VEGFA。30s,60℃30s,72℃30s,40。circ
分子轴是否可介导蛇床子素以为内参以为内
circ_0084043/miR-338-3p_0084043GAPDH,miR-338-3pU6
对糖尿病性心肌病的治疗过程尚未可知因此本研参采用-ΔΔCt法计算相对表
。,,2circ_0084043、miR-338-3p
究采用高糖诱导心肌细胞建立细胞损伤模型达量
H9C2,。
探讨蛇床子素是否可通过调控检测细胞增殖收集各组细胞
circ_0084043/miR-338- MTT:H9C2(1×
影响高糖诱导的心肌细胞增殖凋亡及氧化应激5个接种于孔板孔分别加入
3p、。10/ml)96(150μl/),
材料与方法溶液孔与孔室温避光
1 MTT(20μl/)DMSO(150μl/),
材料与试剂蛇床子素购自长沙上禾生物心肌孵育后检测细胞吸光度值值
;5min(OD)。
细胞购自美国培养基购自美国流式细胞术检测细胞凋亡率收集各组
H9C2ATCC; :H9C2
胎牛血清购自上海玉博生物提取试剂细胞加入预冷洗涤弃上清后将结合缓冲
Gibco;;RNAPBS,500μl
盒逆转录荧光定量试剂购自美国液加入细胞沉淀中分别加入与
、、PCRThermo,5μlAnnexinV-FITC
TM凋亡检测试剂盒试振荡摇晃孵育后检测细胞凋亡率
Fisher;Lipofectamine2000、、MTT5μlPI,10min。
剂购自北京索莱宝检测试剂盒购自南京检测氧化应激指标的水平采用反
;MDA、 MDA、SOD:
建成生物工程研究所兔抗鼠抗体购自美复冻融法裂解各组细胞根据试剂盒说明书检
;Bax、Bcl-2H9C2,
国标记的山羊抗兔二抗购自美国测细胞中的水平
CST;HRPIgGMDA、SOD。
双荧光素酶报告基因检测与
Abcam。 circ_0084043
方法的靶向关系预
miR-338-3p:CircularRNAInteractome
实验分组细胞培养于含有测显示与存在结合位点分
:H9C230mmol/Lcirc_0084043miR-338-3p,
葡萄糖的培养基内培养记为高糖组组别构建野生型载体与突变型载体
24h,(HG)。WT-circ_0084043
细胞培养于含有葡萄糖的培养基内分别
-circ_0084043,miR-NC、miR-338-3pmimics
河北医药年月第卷第期
20225449 HebeiMedicalJournal,2022,
与共转染入活力降低P凋亡率升高P蛋
WT-circ_0084043、MUT-circ_0084043(<),(<),Bax
细胞后继续培养收集细胞并检测荧光素白水平升高P蛋白水平降低P
H9C224h,(<),Bcl-2(<
酶活性与组比较蛇床子素低剂量组
。);HG,HG+、HG+
检测蛋白表达提取各蛇床子素中剂量组蛇床子素高剂量组
WesternblotBax、Bcl-2:、HG+circ_
组细胞总蛋白后检测蛋白浓度取蛋白的表达水平降低P的
H9C2,50μg0084043(<),miR-338-3p
样品进行转膜脱脂奶粉封闭表达水平升高P细胞活力升高P
SDS-PAGE,,5%2h,4℃(<),(<),
条件下孵育一抗稀释液过夜洗涤室凋亡率降低P蛋白水平降低P
(1∶1000),TBST,(<),Bax(<
温条件下孵育二抗稀释液滴加应蛋白水平升高P且不同剂量组
(1∶2000)1h,ECL,),Bcl-2(<),
用软件分析各条带灰度值间比较差异有统计学意义P见图表
ImageJ。(<)。1,1。
统计学分析应用统计软件计量资
,
料以x±s表示组间比较采用独立样本t检验多组
■,2,
间比较采用单因素方差分析P为差异有统计
,<
学意义
。
结果
2
蛇床子素对高糖诱导的损伤的影响与
H9C2
组比较组的表达水平升高P
NC,HGcirc_0084043(<
的表达水平降低P细胞
),miR-338-3p(<),
图蛇床子素对高糖诱导的凋亡的影响蛇床子素对高糖诱导的中蛋白表达的影响蛇床子素可抑制高糖诱导的
1 H9C2;AH9C2Bax、Bcl-2;BH9C2
凋亡
表不同浓度蛇床子素对高糖诱导的损伤的影响nx±s
1 H9C2=3,■
组别值凋亡率
circ_0084043miR-338-3pOD(%)BaxBcl-2
组
±±±±±±
组
±∗±∗±∗±∗±∗±∗
蛇床子素低剂量组
HG+±#±#±#±#±#±#
蛇床子素中剂量组
HG+±#△±#△±#△±#△±#△±#△
蛇床子素高剂量组
HG+±#△☆±#△☆±#△☆±#△☆±#△☆±#△☆
F值

P值

注与组比较P与组比较P与蛇床子素低剂量组比较P与蛇床子素中剂量组比较P
:NC,∗<;HG,#<;HG+,△<;HG+,☆<
表不同浓度蛇床子素对高糖诱导的氧化应激的影响
蛇床子素对高糖诱导的氧化应激的影响2 H9C2
H9C2x±s
与组比较组的水平升高P■
NC,HGMDA(<),组别
MDA(nmol/ml)SOD(U/L)
的活性降低P与组比较蛇组
SOD(<);HG,HG+±±
组
±∗±∗
、HG+、HG+蛇床子素低剂量组
HG+±#±#
子素高剂量组的水平降低P的活蛇床子素中剂量组
MDA(<),SODHG+±#△±#△
蛇床子素高剂量组
性升高P且不同剂量组间比较差异有统计HG+±#△☆±#△☆
(<),F值

学意义P见表P值
(<)。2。
干扰对高糖诱导的损伤的注与组比较P与组比较P与蛇床子素低
circ_0084043H9C2 :NC,∗<;HG,#<;HG+
影响与组比较组剂量组比较△P与蛇床子素中剂量组比较☆P
HG+si-NC,HG+si-circ_0084043,<;HG+,<
的表达升高P细胞活力升高P活性升高P蛋白降低
miR-338-3p(<),(<),SOD(<),Bax
P凋亡率降低P水平降低P蛋白升高P见图表
(<),(<),MDA(<),Bcl-2(<)。2,3。
河北医药年月第卷第期
131020225449 HebeiMedicalJournal,2022,
图干扰对高糖诱导的凋亡的影响干扰可抑制高糖诱导的凋亡干扰对高糖诱导的
2 circ_0084043H9C2;Acirc_0084043H9C2;Bcirc_0084043
中蛋白表达的影响
H9C2Bax、Bcl-2
表干扰对高糖诱导的损伤的影响x±s
3 circ_0084043H9C2■
组别值凋亡率
circ_0084043miR-338-3pOD(%)MDA(nmol/ml)SOD(U/L)BaxBcl-2
组
HG+si-NC ±±±±±±±±
组
HG+si-±±±±±±±±
t值

P值

可逆转蛇床子素对高糖诱导的P的水平升高P的活性
circ_0084043(<),MDA(<),SOD
损伤的影响与蛇床子素高剂量降低P蛋白水平明显升高P
H9C2 HG++(<),Bax(<),
组比较蛇床子素高剂量蛋白水平明显降低差异有统计学意义P
pcDNA,HG++pcDNA-circ_Bcl-2,(<
组细胞的活力降低P凋亡率升高见图表
0084043(<),)。3,4。
图可逆转蛇床子素对高糖诱导的凋亡的影响可逆转蛇床子素对高糖诱导的凋亡的影响
3 circ_0084043H9C2;Acirc_0084043H9C2;Bcirc_
可逆转蛇床子素对高糖诱导的中蛋白表达的影响
0084043H9C2Bax、Bcl-2
表可逆转蛇床子素对高糖诱导的损伤的影响x±s
4 circ_0084043H9C2■
组别值凋亡率
circ_0084043miR-338-3pOD(%)
蛇床子素高剂量组
HG++pcDNA ±±±±
蛇床子素高剂量组
HG++pcDNA-±±±±
t值

P值

组别
MDA(nmol/ml)SOD(U/L)BaxBcl-2
蛇床子素高剂量组
HG++pcDNA ±±±±
蛇床子素高剂量组
HG++pcDNA-±±±±
t值

P值

靶向
circ_0084043miR-338-3p CircularRNA
预测显示与存在
Interactomecirc_0084043miR-338-3p
结合位点过表达可降低野生型载体
。miR-338-3pWT-
的荧光素酶活性P而对突变型
circ_0084043(<),
载体的荧光素酶活性无明显影响
MUT-circ_0084043。图和的互补序列
见图表4 circ_0084043miR-338-3p
4,5。
河北医药年月第卷第期
20225449 HebeiMedicalJournal,2022,
表双荧光素酶报告实验x±s在妊娠高血压患者外周血和胎盘中的表
5 ■miR-338-3p
组别
WT-circ_0084043MUT-circ_0084043达水平升高[13]在脂多糖诱导的人支气
组。miR-338-3p
miR-NC ±±
组管上皮细胞中表达下调可通过充当
miR-338-±±,circ_0038467
t值
[14]本研究
P值miR-338-3p。

讨论,miR-338-3p
3 降低蛇床子素可明显促进的表达且呈
目前糖尿病性心肌病的发病机制尚未阐明体内,miR-338-3p,
,剂量依赖性而过表达可通过抑制
持续处于高糖状态可促进炎症氧化应激等反应的发,circ_0084043miR-
、的表达而明显逆转蛇床子素对高糖诱导的心
生而促进心肌细胞凋亡部分中药的活性成分可减轻338-3p
,肌细胞增殖凋亡及氧化应激的作用
高糖诱导的心肌细胞损伤但其作用途径作用靶点相、。
,、综上所述高糖诱导的心肌细胞中
关研究较少[6]在糖尿病心肌病中表达异 ,circ_0084043
。circRNA的表达水平升高的表达水平降低蛇床
常并可能作为早期诊断及治疗糖尿病心肌病的生物,miR-338-3p,
,子素可抑制的表达而促进
标记物[7]但是否可作为中药治疗糖尿病性circ_0084043miR-338-3p
。circRNA的表达并可促进高糖诱导的心肌细胞增殖而抑制细
心肌病的潜在靶点尚未可知,
。胞凋亡及氧化应激过表达可拮抗蛇床
蛇床子素是从蛇床果实中提取具有抗炎抗癌等,circ_0084043
,、子素对高糖诱导的心肌细胞损伤的作用本研究证实
作用且研究表明蛇床子素可减轻类风湿性关节炎大,
,蛇床子素可通过调控分子
鼠的软骨细胞损伤[8]蛇床子素可减轻大鼠肾脏缺circ_0084043/miR-338-3p
。轴而减轻高糖诱导的心肌细胞损伤
血再灌注损伤并可抑制介导的线粒体凋亡[9]。
,ROS。参考文献
但蛇床子素对高糖诱导的心肌细胞损伤的影响尚未可吴章吕望陈新国等雷公藤红素对高糖诱导的细胞损伤的
1 ,,,.H9C2
保护作用温州医科大学学报
知本研究结果显示高糖诱导的心肌细胞活力与.,2020,50:24-29.
王蕊郝翠君周金才等二氢杨梅素对高糖诱导的心肌细胞
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蛋白水平降低凋亡率与蛋白水平升高与损伤的影响中华细胞与干细胞杂志电子版
.(),2019,9:160-165.
Bcl-2,Bax,张童蛇床子素预处理对大鼠心脏缺血再灌注损伤的作用中医学
报道结果[10]相似提示成功建立糖尿病性心肌病心肌3 ..
,报
细胞损伤模型本研究分析显示蛇床子素处理后高,2017,32:1479-1482.
。,4 LiY,ChengT,WanC,
糖诱导的心肌细胞活力升高凋亡率