重组变构人TRAIL联合5-FU对裸鼠结直肠癌移植瘤的抑制作用.pdf

该【重组变构人TRAIL联合5-FU对裸鼠结直肠癌移植瘤的抑制作用 】是由【dt83088549】上传分享，文档一共【6】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【重组变构人TRAIL联合5-FU对裸鼠结直肠癌移植瘤的抑制作用 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。,
2022年5月HEBEIMEDICINEMay,2022
【文章编号】1006-6233(2022)05-0731-06
重组变构人TRAIL联合5-FU对裸鼠结直肠癌移植瘤的抑制作用
孙同友1,赵丽霞1,崔玉洁2,周硕3,梁秀军4,孙大永1
(.河北省承德市中心医院,河北承德067000
1
.河北省人民医院肿瘤五科,河北石家庄050057
2
.承德医学院研究生院,河北承德067000
3
.承德医学院基础医学研究所,河北承德067000)
4
【摘要】目的:观察重组变构人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(
recombinantmutanthuman
,)或称为环化变构(,)与***尿嘧啶注射液(
TRAILrmhTRAILTRAILcircularpermutedTRAILCPT5-Flu-
,)联用对裸鼠结直肠癌移植瘤的的抗肿瘤作用。方法:将人结直肠癌(
orouracil5-FUhumancolorectal
,)细胞分别接种于每只裸鼠右侧腋窝中部外侧皮下,建立裸鼠移植瘤模型,随机分
cancerCRCHCT116
组后采用尾静脉注射给药,以腹腔注射给药,观察裸鼠一般情况,测量其体重及皮下移植瘤
5-FUCPT
长短径,实验结束处死动物后剥取瘤组织、称量瘤重并拍照,采用法检测细胞凋亡,并应
TUNEL/DAPI
用激光共聚焦显微镜观察。结果:荷瘤裸鼠模型构建成功,荷瘤裸鼠一般情况良好;与对照组相
CRC
比,单药或对裸鼠移植瘤的生长均有抑制作用(),当两药联用时抑制生长作用更加
CPT5-FUP<
明显(),且以高剂量组最为显著;与对照组比较,和单药组及联合用药组裸鼠移
P<-FU
植瘤的体积及瘤重均明显减小();、单药及两者联合都促进了肿瘤细胞凋亡,以联合
P<-FU
组诱导凋亡作用更加显著,相比对照组差异有显著性()。结论:单药及其联合能明显
P<-FU
抑制裸鼠结直肠癌皮下移植瘤的生长,并能诱导裸鼠移植瘤细胞凋亡。
【关键词】移植瘤;结直肠癌;肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;裸鼠
【文献标识码】A【doi】.1006-
InhibitoryEffectofRecombinantMutantHumanTRAIL
inCombinationwith5-FUonTransplantedTumor
ofColorectalCancerinNudeMice
SUNTongyou,ZHAOLixia,etal
(ChengdeCentralHospital,HebeiChengde067000,China)
【Abstract】Objective:
Toobservetheantitumoreffectofrecombinantmutanthumantumornecrosisfac-
()()()
torTNF-relatedapoptosis-inducingligandrmhTRAILorknownascircularpermutedTRAILCPTin
()Methods:
combinationwith5-fluorouracil5-FUontransplantedtumorofcolorectalcancerinnudemice.
()
HumancolorectalcancerCRCcelllineHCT116wasinoculatedsubcutaneouslyintothemiddlelateralaxil-
,
-FUwas

,,

,,

(),
wasdeterminedbyTerminaldeoxynucleotidyltransferasedUTPnickendlabelingTUNEL/24'6-diamidi-
(),Results:
no-2-phenylindoleDAPIassayandobservedandphotographedbyLaserconfocalmicroscope.
,
CRCbearingnudemicemodelwassuccessfullyestablishedandthenudemicewereallingoodcondition.
,
CPTand5-FUalonecouldinhibitthegrowthoftransplantedtumorinnudemiceandthecomparisonofthat
()
withcontrolgrouphasstatisticaldifferenceP<
【基金项目】河北省承德市科技计划项目,(编号:);河北省卫生健康委科研基金项目,(编号:);河北省高
201804A07820211025
等学校科学技术研究项目,(编号:);河北省青年科技计划项目,(编号:)
QN201603120200765
【通讯作者】孙大永
·731·
,
2022年5月HEBEIMEDICINEMay,2022
,
inhibitoryeffectonthegrowthoftransplantedtumorinnudemiceandthehigh-doseCPTgroupwasthemost
(),,
significantP<-FUandco
(),
-treatmentgroupsweresignificantlyreducedP<-FUandtheircombinationpromotedtheap-
,,
optosisoftumorcellsespeciallyinthecombinationgroupandthedifferencewassignificantincomparison
()Conclusion:
withcontrolP<-FUcansignificantlysuppressthe
,
growthofhumanCRCHCT116transplantedtumorsinnudemiceandpromotetheapoptosisoftumorcells
CRCtumor-bearingnudemice.
【Keywords】;;
TransplantedtumorColorectalcancerTumornecrosisfactorrelatedapoptosisindu-
;
cingligandNudemice
结直肠癌(,)是常见的胃肠由联勤保障部队第九八〇医院肿瘤科实验室惠赠;体
colorectalcancerCRC
道恶性肿瘤,起源于结直肠黏膜上皮,包括结肠和直肠重的裸鼠,周龄、雌性,由北京维通
18-22gBALB/c6
的恶性肿瘤,全球范围内的发病率和死亡率分别利华实验动物技术有限公司购买,动物许可证为
CRC[]
占所有恶性肿瘤发病的第位和第位1。我国的形(京)。级的实验动物饲养于恒
32SCXK2016-0011SPF
势也很严峻,根据国家癌症中心发布的年我国恶定温度和湿度的环境中,饲料及饮水均经灭菌处理,一
2015
性肿瘤流行病学数据,发病占全组人群的第笼只裸鼠,每日光照。
CRC3512h
位,其导致的死亡占第位,造成了很大的社会经济负112主要试剂:由北京沙东生物公司馈赠;***
[]5..CPT
担2。对于局限性疾病,手术、放疗和化疗等标准治尿嘧啶注射液由上海旭东海普药业有限公司生产;
[]
疗手段的疗效尚可3,尽管如此,最终以上的患培养液()、缓冲液();(胎
40%1640GibcoPBSHyCloneFBS
者会出现远处转移,目前手段对转移性的治疗仍牛血清,)、含胰酶();
%EDTASigmaTUNEL
然具有挑战性。在过去几十年里,细胞毒性药物联合(罗氏公司)、(上海碧云天公司)、***(上海
DAPI
化疗一直是治疗晚期的主要措施,为了寻求突雅培制药有限公司)、激光扫描共聚焦显微镜(日本
CRCO-
破,人们通过化疗联合生物靶向药物来提高总生存率公司)、冰冻切片包埋剂(美国公
lympusOCTSAKURA
(,),尽管如此,晚期的年生司)、电子游标卡尺(美国公司)、手术器械(美
overallsurvivalOSCRC5Fisher
存率仍然相对较低,仅为左右,与局部区域性国公司)。
14%Fisher
相比,其平均约为个月,疗效不能令人满12方法
CR[C]OS30.
意4。因此,探索新的针对晚期的有效药物及治121细胞培养及建立裸鼠移植瘤模型:人细胞
CRC..CRC
疗手段显得尤为重要。()是野生型培养于培养基(含胎牛血
rmhTRAILCPTHCT116RPMI-164010%
环化变构而来,其在安全性、稳定性、溶解性及清)中,并置于、及饱和湿度的培养箱内,
2
TRAIL[]5%CO37℃
抗癌生物活性方面都表现的更佳5。课题组前期体每天换液次,用胰蛋白酶溶液消化细胞传代。将
1
外研究结果显示单药及其与联用对细胞制成单细胞悬液,用细胞计数板计数,测
CPT5-FU[]CRCHCT116
细胞增殖有明显抑制作用,并能诱导细胞凋亡5。实得细胞悬液密度为7个,于只裸鼠右侧腋
5×10/mL25
验动物模型是体外细胞实验结果向体内研究结果转化窝中部外侧皮下分别注射单细胞悬液。
120μL
的桥梁,在癌症发生机制及药理学研究中都发挥着关122实验动物分组及给药:自接种之日起,每隔
..1d
键作用。皮下接种异位移植瘤模型因为其操作简单、观察裸鼠右侧腋窝接种部位皮下成瘤情况,利用游标
成瘤率高及肿瘤生长快等特点,是人类研究癌症过程卡尺测量裸鼠结直肠癌移植瘤的长短径,并根据公式
[]
中最常使用的方法之一6。故本实验选择周龄雌性算出肿瘤体积,公式:肿瘤体积长径短径2。实
6=1/2××
裸鼠,建立***下移植瘤模型,研究验分组:待皮下移植瘤大小至3时,将
BALB/cCRCCPT100-120mm25
单药及其与联合对裸鼠皮下移植瘤的抑制作只裸鼠随机分为组,每组只:对照组,组,
5-FU555-FU
用,以期为今后临床应用治疗结直肠癌提供理论组,低剂量联合组及高剂量组联
CPTCPTCPT5-FUCPT
依据。合组,每组只。治疗剂量及方法:对照组注射
5-FU5
1材料与方法生理盐水;组每次的剂量为每只,采取尾
5-FU5mg/kg
11材料静脉注射的方式;单药组的剂量为每次每只
.CPT7.
111实验细胞和实验动物:人细胞株,以腹腔注射的方式给药;联合组,
..CRCHCT1165mg/kgCPT5-FU5
·732·
,
2022年5月HEBEIMEDICINEMay,2022
给药剂量及方式同前,腹腔注射剂量为每次
-FUCPT
每只或,两药给药间隔时间为。
/kg4h
每注射一次,一共给药次。基于预实验结果及
2d10[]
既往文献报道选择给药剂量以及给药方式7。
123观察实验动物的一般情况、测量体重及肿瘤长
..
短径:自用药当天开始,每天观察并记录动物的精神、
活动、饮食、饮水等一般表现,并观察皮下移植瘤有无
红肿破溃;裸鼠体重每测量次、并测量皮下移植
5d1
瘤的长短径。所有动物均在用药第天采用颈椎脱图与联用对实验动物体重的影响
251CPT5-FU
臼法迅速处死,剥离肿瘤,测量大小,称量瘤重,拍摄照22联合对裸鼠皮下移植瘤的生长抑制
.CPT5-FU
片,根据公式算出第天时的移植瘤肿瘤抑制率和体作用:人裸鼠皮下移植瘤模型构建成功,重复测
25CRC
积抑制率。肿瘤抑制率(实验组瘤重对照组瘤量的方差分析结果显示:时间和药物之间具有交互效
=1-/
重);肿瘤体积抑制率(实验组瘤体积对应(交互,),且药物和时间对裸鼠皮
×100%=1-/F=<
照组瘤体积)。下移植瘤的影响均有统计学意义(分组,
×100%F=<
124双染检测细胞凋亡:将剥除的移;时间,),皮下移植瘤体积随
..TUNEL/=<
植瘤组织用冰冻切片机制成冰冻切片,切片的厚度着时间的延长而逐渐增大,与其它组比较,高剂量
CPT
。按(末端脱氧核苷酸转移酶“”介联合组移植瘤体积增大最为迟缓()。在
3μmTUNELdUTP5-FUP<
导的缺口末端标记法)(,二脒基各时间点与对照组比较,单用或均能抑制
dUTP/DAPI4'6--2-CPT5-FU
苯基吲哚二盐酸盐)试剂盒操作说明检测细胞凋亡:裸鼠***下移植瘤生长();当与
CRCP<-
多聚甲醛常温固定切片,用漂洗,联合时,抑制***下移植瘤的生长作用愈加
4%20minPBS30minFUCRC
细胞通透液破膜通透,漂洗后加反显著,且以高剂量()联合组最为
-FU
应混合液(荧光素标记的)避光孵育明显,与其它组比较差异有统计学意义(),联
TdT+dUTPP<
,加避光孵育,漂洗次后用甘合组之间比较差异也有统计学意义()。实验
60minDAPI5minPBS3P<
油封片,用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况,结束时,以对照组裸鼠移植瘤体积最大,而高剂量
CPT
于倍视野下计数凋亡细胞数,并拍照。联合组的肿瘤体积最小。见图和表。剥取
4005-FU21
13统计学处理:实验数据采用统计软件肿瘤称量瘤重,统计显示:各组间差异具有统计学意义
.
分析,符合正态分布的计量资料以均数标准差()(,),对照组肿瘤质量最大,单药
±x■±sF=<-
表示,单因素方差分析()进行多组间及组的瘤重与对照组比较差异有统计学意义
one-wayANOVAFUCPT
比较,两样本间均数比较采用检验;重复测量(),但两单药组之间比较差异无统计学意义(
LSD-tP<
的方差分析对重复测量变量进行比较,表示差);联合组与单药组及对照组相比差异有统计学
P<>
异有统计学意义。意义(),而两联合组之间比较差异无统计学意
P<
2结果义()。见图、图、表。
P>
21和对实验动物生活状态的影响:在研
.CPT5-FU
究进程中,给药后实验动物均一般情况良好,未出现精
神萎靡、行动迟缓、不思饮食等情况;移植瘤表面未见
出血及坏死,每组裸鼠均未见死亡发生。统计显示,药
物对裸鼠体重的影响无统计学意义(,
F药物==
),时间对裸鼠体重的影响有统计学意义(
=
,),分组和时间对动物体重影响的交
<
互作用有统计学意义(,)。从实
F交互=<
验开始到第天各组动物体重逐渐增大,而从第
1010图联合对皮下移植瘤体积的影响
天到实验结束,只有对照组和组动物体重小幅上2CPT5-FU
CPT注:与()组比较,;与、
+5-FU∗P<
升,其它组动物体重逐渐减小。见图。或对照组比较,
1-FU#P<
·733·
,
2022年5月HEBEIMEDICINEMay,2022
23联合对人裸鼠皮下移植瘤细胞
.CPT5-FUCRC
凋亡的影响:激光共聚焦显微镜扫描显示
TUNEL/DA-
染色后联合治疗的裸鼠肿瘤细胞呈绿
PICPT5-FU
色荧光,而未经治疗的对照组或单药及组
CPT5-FU
治疗的裸鼠肿瘤细胞没有显示明显的绿色荧光,表明
与联用诱导裸鼠皮下移植瘤细胞发生了凋
CPT5-FU
亡;对凋亡肿瘤细胞数进行计数,统计显示:各组间均
数差异具有统计学意义(,),其它
F=<
组与对照组比较均有统计学意义(),联合组
P<
与两单药组相比差异也有统计学意义(),联合
P<
图联合对皮下移植瘤的生长抑制作用组之间比较差异也有统计学意义()。见图、
3CPT5-FUP<
表。
3
图联合对皮下移植瘤重量的影响
4CPT5-FU
表1实验结束时裸鼠移植瘤体积及抑瘤率(,)
■=图联合对皮下植瘤细胞凋亡的影响
x±sn55CPT5-FU
分组瘤体积(3)抑瘤率()注:()原始放大倍数;()阳性细胞定
mm%A×400BTUNEl/DAPI
量;与()组比较,;与其它组比
+5-FU∗P<
±,
#P<
组∗
5-FU1208±
表3肿瘤凋亡细胞数(,)
组∗x■±sn=8
±
分组凋亡细胞数
低剂量组∗
CPT+5-FU760±
对照组
高剂量组∗±
CPT+5-±
组
注:与对照组相比,5-±
∗P<
组
±
表2裸鼠移植瘤质重及瘤重抑制率(,)
x■±sn=5低剂量组∗
CPT+5-±
分组瘤重()瘤重抑制率()
g%高剂量组∗
CPT+5-±
对照组
±:与组或组相比,
5-FUCPT∗P<
组∗
5-±
组∗随着分子生物学和分子诊断技术的迅速发展,科
±
学家们认识到癌症发生不仅涉及细胞凋亡通路受阻、
低剂量组∗
CPT+5-±,还可由一种或多种抑癌基因
高剂量组∗
CPT+5-±,是一个多步骤多阶段的
注:与对照组相比,;与组或组相比,复杂过程。发生的危险因素主要包括遗传易感
∗P<-FUCPTCRC
性、表观遗传学改变、饮酒、高脂肪饮食、缺乏运动以及
P<
·734·
,
2022年5月HEBEIMEDICINEMay,2022
[]
肠道黏膜的慢性炎症等8。从结肠腺瘤发展到本研究应用染色法检测移植瘤细
CRCTUNEL/DAPI
涉及到多个基因的缺失或突变,包括基因缺失、胞凋亡情况,结果显示、及两者联合治疗也
APCCPT5-FU
癌基因突变以及抑癌基因和的缺失引起了移植瘤细胞凋亡,激光扫描共聚焦显微镜下可
RA[S]DCCp53
等9。基于对癌症发病机制的深入认识,针对癌症发见代表细胞凋亡的绿色荧光,以大剂量联合
CPT5-
生发展的某个或某些靶点进行精准打击的靶向治疗在引起的裸鼠移植瘤细胞凋亡最明显,且与其它组比
FU
恶性肿瘤治疗中取得了很大进展,而在中以靶向较具有统计学意义(),这与体外实验结果一
CRCP<
抗肿瘤血管生成治疗药物进展最为迅速,这类药物主致。而两单药组之间相比细胞凋亡没有显著差异,考
要包括针对血管内皮生长因子()和表皮生长因虑主要与用药剂量较小及机体复杂代谢环境等因素有
VEGF
子受体()的大分子单抗以及血管内皮生长因子关。本研究首次探讨联用对的治疗
EGFRCPT5-FUCRC
受体()的小分子酪氨酸激酶抑制剂(作用,有很多方面需要总结和完善,比如选择不同的
[VE]GFRVEGFR-
)10。虽然靶向抗肿瘤血管生成药物在治细胞系、尝试多种剂量组合方案、对移植瘤组织
TKIsCRCCRC
疗中取得了一定疗效,但是由于缺乏有效且可靠的预中凋亡通路有关分子进行检测等。
测疗效的标志物以及获得性耐药等问题,总体疗效仍综上,本研究结果表明单药及其与联
CPT5-FU
不尽如人意。近几年,免疫治疗药物异军突起,给肿瘤合治疗在体内也展示出了良好的抗肿瘤活性,且
CRC
病人带来了新的希望和治疗选择。在有高度微卫星不对实验动物无明显毒性。这为深入探索联合
CPT5-
稳定错配修复功能缺陷()的转移性结治疗提供了实验基础。
/MSI-H/dMMRFUCRC
直肠癌(,)中,免疫治【参考文献】
metastaticColorectalCancermCRC
[][],,,
疗的疗效较传统治疗手段显著提高11,但是,
5%:
左右的患者伴有,而不具备2020GLOBOCANestimatesofincidenceandmortality
mCRCMSI-H/dMMRMSI[]
的对免疫治疗的反应性较差。
-H/dMMRmCRC,,():
不同于传统的化疗药物,也不同于靶向以Clin2021713209~249.
TRAIL[]郑荣寿,孙可欣,张思维,等年中国恶性肿瘤流行情
及免疫治疗药物,它能靶向性的杀伤肿瘤细胞,
况分析[]中华肿瘤杂志,,():
~28.
常细胞没有毒性,这使它成为被寄予厚望的抗癌明星[],,,
-
因子。是由环化变构后得到,其在稳定()
CPTTRAILerofthecolonandrectumJSCCRguidelines2019forthe
性、半衰期及抗癌活性等方面均强于。我们第[],,

一次报道了单药及其联合在体外能抑制():
CPT5-FU11~42.
[],,,
细胞的增殖并能诱导其凋亡。
CRC:
功能和结构方面与人类相似,被认为是研究良好outcomesinpatientswithstageIVcoloncancerApopulation
CRC[],,():
的模型。将细胞悬液注射于裸鼠腋下建立了-~373.
BALB/C[],,,
移植瘤模型,来评价药物的抗肿瘤活性。-
CRC()
究中,我们也成功构建了人裸鼠皮下移植瘤模cularlypermutedtumornecrosisfactorTNF-relatedapop-
CRC()(
型并应用联合的方案治疗观察体内抗肿tosis-inducingligandTRAILrecombinantmutanthuman
,,)
CPT5-FUTRAILincombinationwith5-Fluorouracilinhumancolor-
瘤效果,的用量为,远低于临床常用剂[]
5-FU5mg/kg[,]
量,且明显低于其它实验中的用量1213。结果显示:,,():
Monit20182442550~2561.
各组实验动物对治疗方案耐受性良好,未出现拒食、死[],,,
6Nascimento-GoncalvesEMendesBALSilva-ReisRetal.
亡等情况各组动物在体重上未见明显差异单药:
,。Animalmodelsofcolorectalcancerfromspontaneoustoge-
[]
或联合均能抑制移植瘤生长;
CPTCPT5-FUCRC,,():
制移植瘤生长体积曲线显示与对照组相比,治疗组移Sci20218459.
[],,,
植瘤的生长速度明显较慢,
CPT5-FU
联合组移植瘤的生长最慢;称量裸鼠移植瘤的瘤重,结cancercellstoTRAILinducedapoptosisviaERKmediated
[],,():

821~834.
及单药组,并且以的联合组瘤重[],,,
--
减轻最显著,这表明高浓度有更强的抑制裸鼠移
CPTtumoreffectoflactococcusiactisbacteria-secretinghuman
植瘤生长作用,与体外实验结果一致。
solubleTRAILcanbeenhancedbymetforminbothInvitro
·735·
,
2022年5月HEBEIMEDICINEMay,2022
[],,,
-
[](),,():[]
-Instability-HighAdvancedColorectalCancerJ.
[],,,,,():
-NEnglMed2020383232207~2218.
[],,,

consequencesongeneexpressionlevelsanddiseaseoutcomecolorectalcancercellsthroughROS/JNKsignalingpathway
[],,():[],,():
~