黄芩苷对复发性口腔溃疡模型大鼠IL-33 ST2信号通路的影响及机制研究.pdf

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2022年8月HEBEIMEDICINEAug.,2022
【文章编号】1006-6233(2022)08-1262-06
黄芩苷对复发性口腔溃疡模型大鼠IL-33/ST2
信号通路的影响及机制研究
魏雅楠,刘晓慧,马远新
(河北省沧州中西医结合医院,河北沧州061000)
【摘要】目的:探讨黄芩苷通过调控白细胞介素肿瘤发生抑制蛋白()信号通路
-33/2IL-33/ST2
对复发性口腔溃疡()模型大鼠的治疗作用及其机制研究。方法:只大鼠采用自体抗原注射法构
ROU50
建模型,并将其随机分成模型组,低、中、高剂量黄芩苷(、、)组和左旋咪唑组(
ROU2550100mg/kg17.
),另取只仅注射弗氏完全佐剂的大鼠作为正常组。灌胃给药结束后,观察并记录各组大鼠
5mg/kg10
溃疡数目、持续时间、间隔时间;流式细胞仪检测各组大鼠外周血淋巴细胞亚群+、+含量;酶
TCD4CD8
联免疫分析法检测各组大鼠血清中干扰素()、、、肿瘤坏死因子()水平;还
-γIFN-γIL-17IL-2αTNF-α
原型谷胱甘肽()、超氧化物歧化酶()、丙二醛()测试盒检测各组大鼠血清中、、
GSHSODMDAGSHSOD
含量;免疫印迹法检测各组大鼠口腔黏膜组织中、、核因子()蛋白水平。结
MDAIL-33ST2kBNF-kB
果:与正常组相比,模型组大鼠溃疡数目增多,持续时间增加,间隔时间延长,+及++降低,
CD4CD4/CD8
+升高,、、、、含量增加,、含量减少,、、蛋白表
CD8IFN-γIL-17IL-2TNF-αMDAGSHSODIL-33ST2NF-kB
达上调()。与模型组相比,低、中、高剂量黄芩苷组大鼠溃疡数目和持续时间减少,间隔时间延
P<
长,+及++增加,+减少,、、、、含量下降,、含量上
CD4CD4/CD8CD8IFN-γIL-17IL-2TNF-αMDAGSHSOD
升,、、蛋白表达下调(),且呈现剂量依赖性。高剂量黄芩苷与左旋咪唑组的各
IL-33ST2NF-kBP<
项指标差异不具有统计学意义()。结论:黄芩苷对模型大鼠有明显的治疗作用,可能抑制
P>
通路,调控淋巴细胞亚群失衡,改善炎症反应和氧化损伤。
IL-33/ST2T
【关键词】黄芩苷;信号通路;复发性口腔溃疡;淋巴细胞亚群;氧化应激
IL-33/ST2T
【文献标识码】A【doi】.1006-
EffectofBaicalinonIL-33/ST2SignalingPathwayinRatswith
RecurrentOralUlcersandItsMechanism
WEIYa'nan,LIUXiaohui,MAYuanxin
(CangzhouHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWestern
Medicine,HebeiCangzhou061000,China)
【Abstract】Objective:
Toinvestigatethetherapeuticeffectofbaicalinonmodelratswithrecurrentoral
()(
ulcerROUanditsmechanismbyregulatingtheinterleukin-33/suppressionoftumorigenicity2IL-33/
)Methods:

,,,(,,),
andrandomlydividedintomodelgrouplowmediumandhighdosebaicalin2550100mg/kggroups
();
'scompleteadjuvantweretakenas
,,
-
;+
cersofratsineachgroupwereobservedandrecordedflowcytometrywasusedtodetectthecontentsofCD4
+;
andCD8Tinlymphocytesubsetsintheperipheralbloodofratsineachgroupenzyme-linkedimmunoassay
(),,,()
wasusedtodetectthelevelsofinterferon-γIFN-γIL-17IL-2andtumornecrosisfactor-αTNF-α
;(),(),
intheserumofratsineachgroupreducedglutathioneGSHsuperoxidedismutaseSODmalondialde-
(),
hydeMDAtestkitswereusedtodetectthelevelsofGSHSODandMDAintheserumofratsineach
;,,()
groupWesternblottingwasusedtodetectthelevelsofIL-33ST2andnuclearfactor-kBNF-kBpro-
Results:,

【基金项目】河北省中医药管理局科研计划课题,(编号:)
2020509
·1262·
,
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,,,+
ulcersinthemodelgroupincreasedthedurationincreasedandtheintervaltimeprolongedtheCD4and
++,+,,,,,
CD4/CD8decreasedtheCD8increasedthecontentsofIFN-γIL-17IL-2TNF-αandMDAin-
,,,,
creasedthecontentsofGSHandSODreducedtheexpressionofIL-33ST2andNF-kBproteinswasup
(),,
-regulatedP<
,,+++
andhighdosebaicalingroupsdecreasedandtheintervaltimeprolongedtheCD4andCD4/CD8in-
,+,,,,,,
creasedtheCD8thecontentsofIFN-γIL-17IL-2TNF-αandMDAdecreasedthecontentsof
,,,(
GSHandSODincreasedtheexpressionofIL-33ST2andNF-kBproteinswasdown-regulatedP<0.
),
05andtheyweredose-
()Conclusion:
high-dosebaicalingroupandlevamisolegroupP>
,
-33/ST2pathwayregulatetheimbalanceofTlymphocytesub-
,
setsandimproveinflammatoryresponseandoxidativedamage.
【Keywords】;;;
BaicalinIL-33/ST2signalingpathwayRecurrentoralulcerTlymphocytesub-
;
setsOxidativestress
复发性口腔溃疡(,)是常素(,)、白细胞介素(,
Recurrentoralulce[r]ROU-γInterferon-γIFN-γinterleukin
见的口腔疾病,其发病率高,多见于女性1。临床上,)、、肿瘤坏死因子(
IL-17IL-2αtumornecrosisfactor
该病的主要症状是唇、舌、软腭等黏膜部位反复出现溃,)酶联免疫吸附试剂盒购自江苏生物科技有
αTNF-α
疡,表现为圆形或者椭圆形,通常伴有局部的红肿和灼限公司;还原型谷胱甘肽(,)、超氧化物
[]glutathioneGSH
痛2。目前,该病的诱因以及发病机制还不完全清歧化酶(,)、丙二醛(
superoxidedismutaseSODmalondi-
楚。的临床治疗通常是采用西药进行消炎、止痛,)测试盒购自南京建成生物研究所;
ROUaldehydeMDAIL-
并促进溃疡部位愈合,但效果并不显著,而传统的中草、、核因子(,)单克隆
[]33ST2kBNuclearfactor-kBNF-kB
药对有较好的治疗作用3。黄芩苷主要取自黄抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国
ROUAbcam
芩的干燥根部,是一种黄***类生物活性物质,具有抗公司。组织匀浆机购自上海净信实业发展有限公司;
[][]
炎、杀菌、镇痛之疗效4。既往研究5表明甘草泻心酶标仪购自美国伯乐公司;垂直电泳仪购自常州德杜
汤对的治疗效果明显,且复发率低。黄芩苷是甘精密仪器有限公司;流式细胞仪购自美国公司。
ROUBD
草泻心汤的主要成分之一,因此本研究推测单独黄芩13实验分组、造模及给药方法:按照随机数字表法
[].
苷治疗可能对有同样的作用。相关文献6显示将只大鼠分成正常组,模型组,低、中、高剂量黄芩
ROU60
黄芩苷通过抑制白细胞介素肿瘤发生抑制蛋白苷组和左旋咪唑组,每组只。除正常组外,其余各
-33/2[]10
(,组大鼠均按照等7的方法进行造模:大鼠
Interleukin-33/suppressionoftumorigenicity2IL-33/XieLROU
)信号通路影响炎症因子表达,进而改善过敏性鼻麻醉后在口腔黏膜下注入生理盐水,剥离黏膜并制备
ST2
炎。但黄芩苷能否通过调控该通路影响进展未成组织匀浆,将其与按照比例混合均匀。
ROUCFA1∶1
见报道。因此,本研究通过黄芩苷干预观察其对造模前将各组大鼠的两侧脊柱进行脱毛,造模时将
ROU1d
模型大鼠的疗效及其与信号通路的关系。的抗原乳化液皮下注射至脊柱左右区域,每周
IL-33/
1材料与方法一次,持续周,正常组仅注射。模型构建成功
8CFA
11实验动物:周龄健康雄性清洁级后,低、中、高剂量黄芩苷组大鼠分别灌胃、、
.8SpragueDawley2550
大鼠,体重,均购于北京实验动物研究中心黄芩苷,左旋咪唑组大鼠灌胃左
200~220g100mg/[kg]
有限公司,(京)为其动物许可证号。旋咪唑8,正常组和模型组大鼠每天灌胃等量的生理
SYXK2021-0045
所有大鼠自由进食、喝水,均饲养在恒温恒湿、光盐水,每天次,持续。
12h120d
照、黑暗的环境下。14大鼠溃疡症状的观察和记录:给药结束后,肉眼
12h.
12药物、试剂与仪器:弗氏完全佐剂()购自江观察并记录各组大鼠口腔溃疡症状,包括溃疡数目、持
.CFA
苏科惟生物技术有限公司;黄芩苷(纯度)购自续时间、间隔时间。
≥98%
成都仪睿生物科技有限公司;左旋咪唑(纯度)15大鼠外周血淋巴细胞亚群含量的测定:取
≥99%.T
购自上海源叶生物科技有限公司;淋巴细胞亚群检抗凝处理后的大鼠外周血,将其放入流
T100μLEDTA
测试剂盒购自北京同生时代生物技术有限公司;干扰式管底部,分别加入、、
20μLAPC-CD3PE-CD4FITC-
·1263·
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抗体,混合均匀,后在加入溶血素,继膜上,封闭后加入、、一抗,次日加入
CD820min2mLIL-33ST2NF-kB
续混匀,静置,离心、弃去上清液,并用对细二抗,孵育结束后进行显影,并以为内参,分
10minPBSβ-actin
胞进行重悬,最后使用流式细胞仪检测+、+水析不同蛋白表达水平。
CD4CD8
平,并计算++比值。19统计学分析:实验所得计量数据均以()表示,
CD4/±s
16大鼠血清细胞因子水平的测定:各组大鼠给药结并采用对其进行统计分析,多组间差异比较
.
束后,将其麻醉,经腹主动脉取血,放在不含抗凝使用单因素方差分析,且认为差异有统计学意
10mLP<
剂的试管中,静置后,离心,取上清液,一部分依义。
30min
据酶联免疫吸附试剂盒方法检测、、、2结果
IFN-γIL-17IL-2
水平。21黄芩苷对大鼠溃疡状况的影响:与正常组
TNF-
17大鼠血清氧化应激标志物含量的测定:取中相比,模型组大鼠溃疡数目增多,持续时间显著增加,
.
剩余血清,检测其、、含量,具体操作方间隔时间显著延长();与模型组相比,低、中、
GSHSODMDAP<
法严格根据对应试剂盒说明书进行。高剂量黄芩苷组大鼠溃疡数目和持续时间明显减少,
18大鼠口腔黏膜组织中信号通路相关间隔时间明显延长(),表现为剂量依赖性,而
.IL-33/ST2P<
因子蛋白水平的检测:将各组大鼠***后,取其口腔左旋咪唑组与高剂量黄芩苷组间大鼠溃疡数目、持续
黏膜组织,将其研磨成匀浆,提取总蛋白,定量后上时间和间隔时间无明显变化(),见表。
P>
凝胶电泳仪分离蛋白,并将其转至
SDS-PAGEPVDF
表1黄芩苷对ROU大鼠溃疡状况的影响(,)
x±sn=10
组别溃疡数目(个)持续时间()间隔时间()
dd
正常组
000
模型组aaa
±±±
低剂量黄芩苷组bbb
±±±
中剂量黄芩苷组bcbcbc
±±±
高剂量黄芩苷组bcdbcdbcd
±±±
左旋咪唑组bcdbcdbcd
±±±


注:与正常组比较,;与模型组比较,;与低剂量黄芩苷组比较,;与中剂量黄芩苷组比较,
aP<<<<
22黄芩苷对大鼠外周血淋巴细胞亚群含量含量及++显著增加,+含量显著减少(
.ROUTCD4/CD8CD8P<
的影响:与正常组比较,模型组+含量及+),而低剂量黄芩苷组+变化较小,没有显著差
CD4CD4/
+降低,+含量升高(),且差异均有统计异();与高剂量黄芩苷组相比,左旋咪唑组上
CD8CD8P<>
学意义;与模型组比较,低、中、高剂量黄芩苷组+述指标均无明显改变(),见表。
CD4P>
表2黄芩苷对ROU大鼠外周血T淋巴细胞亚群含量的影响(,)
x±sn=10
组别++++
CD4/%CD8/%CD4/CD8
正常组
±±±
模型组aaa
±±±
低剂量黄芩苷组bb
±±±
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,
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中剂量黄芩苷组bcbcbc
±±±
高剂量黄芩苷组bcdbcd
±±±
左旋咪唑组bcdbcd
±±±


注:与正常组比较,;与模型组比较,;与低剂量黄芩苷组比较,;与中剂量黄芩苷组比较,
aP<<<<
23黄芩苷对大鼠血清细胞因子的影响:模型组(),而左旋咪唑组、、、
.ROUP<-γIL-17IL-2TNF-
组大鼠血清中、、、含量明显含量与高剂量黄芩苷组的差异不具有统计学意义(
IFN-γIL-17IL-2TNF-ααP
多于正常组();低、中、高剂量黄芩苷组大鼠血),见表。
P<>
清中、、、含量依次低于模型
IFN-γIL-17IL-2TNF-α
表3黄芩苷对ROU大鼠血清细胞因子的影响(,)
x±sn=10
组别()()()()
IFN-γpg/mLIL-17pg/mLIL-2pg/mLTNF-αng/L
正常组
±±±±
模型组aaaa
±±±±
低剂量黄芩苷组bbbb
±±±±
中剂量黄芩苷组bcbcbcbc
±±±±
高剂量黄芩苷组bcdbcdbcdbcd
±±±±
左旋咪唑组bcdbcdbcdbcd
±±±±


注:与正常组比较,;与模型组比较,;与低剂量黄芩苷组比较,;与中剂量黄芩苷组比较,
aP<<<<
24黄芩苷对大鼠血清氧化应激水平的影响:减少(),呈剂量依赖性;而与高剂量黄芩苷组
.ROUP<
与正常组相比,模型组、含量明显下降,相比,左旋咪唑组、升高不显著、下降不
GSHSODMDAGSHSODMDA
含量明显上升();与模型组相比,低、中、高剂显著(),见表。
P<>
量黄芩苷组、含量显著增加,含量显著
GSHSODMDA
表4黄芩苷对ROU大鼠血清氧化应激水平的影响(,)
x±sn=10
组别()()()
GSHnmoL/mLSODnmoL/mLMDAμmoL/mL
正常组
±±±
模型组aaa
±±±
低剂量黄芩苷组bbb
±±±
中剂量黄芩苷组bcbcbc
±±±
高剂量黄芩苷组bcdbcdbcd
±±±
左旋咪唑组bcdbcdbcd
±±±
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注:与正常组比较,;与模型组比较,;与低剂量黄芩苷组比较,;与中剂量黄芩苷组比较,
aP<<<<
25黄芩苷对大鼠口腔黏膜组织中达显著下调(),且低剂量黄芩苷组中剂量黄
.ROUIL-33/ST2P<>
信号通路相关蛋白表达的影响:与正常组相比,模型组芩苷组高剂量黄芩苷组;而左旋咪唑组与高剂量黄芩
>
大鼠口腔黏膜组织中、、蛋白表达显苷组、、蛋白表达没有明显差异(
IL-33ST2NF-kBIL-33ST2NF-kBP>0.
著上调();与模型组相比,低、中、高剂量黄芩)。见图、表。
P<
苷组大鼠口腔黏膜组织中、、蛋白表
IL-33ST2NF-kB
表5黄芩苷对ROU大鼠口腔黏膜组织中IL-33/ST2信号通路相关蛋白表达的影响(,)
x±sn=10
组别
IL-33ST2NF-kB
正常组
±±±
模型组aaa
±±±
低剂量黄芩苷组bbb
±±±
中剂量黄芩苷组bcbcbc
±±±
高剂量黄芩苷组bcdbcdbcd
±±±
左旋咪唑组bcdbcdbcd
±±±


注:与正常组比较,;与模型组比较,;与低剂量黄芩苷组比较,;与中剂量黄芩苷组比较,
aP<<<<
工作产生非常不利的影响。中医学将归类到“口
ROU
疮”范畴,认为的病症虽在口腔中,但其发生发展
ROU
与人们的五脏六腑联系密切。近年来发现,中草药在
[]
的治疗方面有着不可替代的作用3。黄芩苷是
ROU
从中药黄芩根中提取的生物活性物质,其功能多样,例
[][][]
如抗癌9、抗炎4等。以往研究5发现甘草泻心汤可
减轻患者口腔炎症反应,有助于其黏膜的修复,
ROU
在预防病情反复发生效果显著。黄芩苷作为甘草泻心
汤的主要成分之一,可能对有类似的治疗效果。
ROU
因此,本研究通过建立大鼠模型,观察黄芩苷对
ROU
的治疗效果并探讨其作用机制。
ROU[]
相关研究7表明的发生与自身免疫失调有
ROU
图各组大鼠口腔黏膜组织中、、蛋白关,+和+是淋巴细胞的两个亚群,二者作用
1IL-33ST2NF-kBCD4CD8T
表达水平相反,互相制衡和调节,是检测机体免疫反应水平的重
注::正常组,:模型组,:低剂量黄芩苷组,:中剂量黄芩苷要指标,++比值的降低可使口腔黏膜发生局
ABCDCD4/CD8
组,:高剂量黄芩苷组,:左旋咪唑组部溃疡本研究结果显示模型组大鼠溃疡数目和持
EF。,
3讨论续时间明显增加,间隔时间明显延长,+含量及
CD[4]
食物、心情、激素、口腔的局部创伤及菌群失调均++降低,+含量升高,与曲宸等10和
CD[4]/CD8CD8XieL
能诱发。该病一旦发作就疼痛难忍,且容易反等7的研究结果一致,说明大鼠模型构建成功,
ROUROU
复,不仅影响饮食,还妨碍语言、情绪,对人们的生活、也进一步揭示的发生与细胞免疫有关。经黄芩
ROU
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,
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苷治疗后,大鼠的溃疡病症明显改善,+含量[]李振华,李保双,刘启泉,等消化系统常见病复发性口腔
ROUCD42.
溃疡中医诊疗指南(基层医生版)[]中华中医药杂志,
及++显著增加,揭示黄芩苷通过调节淋巴J.
CD4/CD8T,():
细胞亚群失衡对大鼠有明显的治疗作用。201934115284-5290.
ROU[],
血清中、、、
IFN-γIL-17IL-2TNF-α[],
的异常表达是导致发生的主要因素之一,
ROUIFN-γ,():
是细胞分泌的细胞因子,其水平与溃疡病情的严20204367-69.
Th1[],,,
[]4RizzoVFerlazzoNCurrò-inducedautoph-
重程度呈正比11。是一种促炎因子,由活化的
IL-17agypreservedLPS-stimulatedintestinalcellsfrominflamma-
细胞分泌而来,能够刺激上皮细胞炎症因子的释放,[]
T[]
进而导致机体炎症的发生12。的增多会诱导,,():
TNF-αSci20212252315-2326.
等炎症因子的产生,致使炎性细胞浸润增加,从[]刘晓慧,刘永红,张晓光,等甘草泻心汤加味治疗寒热错
5.
IL-2[]
而加重溃疡程度13本研究发现黄芩苷可下调炎症杂型复发性口腔溃疡疗效及机制研究[]现代中西医结
。,J.
合杂志,,():
因子水平,说明黄芩苷可通过调节淋巴细胞亚群失202130121300-1304.
T[],,,
衡影响炎症因子的水平,
ROU[]
应。IL-33-ST2--
,,():
炎症反应的加剧导致大量自由基产生,进而使机nol2018912004-2011.
[],,,
体发生氧化应激损伤。-driedgano-
dermaiucidummyceliaonarecurrentoralulcerationrat
发生的原因之一,、和是检测机体[],,():
ROUGSHSOD[]-
氧化应激水平的标志物。有文献14显示,在口腔溃疡
522.
发生时,、含量升高,含量下降。本研究[]王金凤,刘文辉,荆雪宁,等甘草泻心汤配方颗粒剂对复
GSHSODMDA8.
结果显示,黄芩苷可通过提高、含量、降低发性口腔溃疡模型大鼠的作用[]中国实验方剂学杂
GSHSODJ.
含量降低大鼠的氧化损伤,进而对起志,,():
MDAROUROU20142011143-146.
[],,
治疗作用。
[],,

():
损伤对产生治疗作用,但是其具体机制还不清1641105387-105457.
ROU[]曲宸,庞晓霞,陈明铭,等独一味胶囊联合维生素
楚。
IL-33ST2IL-1()对复发性口腔溃疡大鼠的治疗效果研究[]中医
白()组成的异二聚体受