卵泡抑素相关基因3对肿瘤相关巨噬细胞在乳腺癌增殖、迁移和侵袭中的机制研究.pdf

该【卵泡抑素相关基因3对肿瘤相关巨噬细胞在乳腺癌增殖、迁移和侵袭中的机制研究 】是由【夸客客】上传分享，文档一共【7】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【卵泡抑素相关基因3对肿瘤相关巨噬细胞在乳腺癌增殖、迁移和侵袭中的机制研究 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。
海军医学杂志年月第卷第期,,,··
·论著·
卵泡抑素相关基因3对肿瘤相关巨噬细胞在乳腺癌增殖、
迁移和侵袭中的机制研究
吕凌云,彭宇,鲁亚琴,房贺,陈艳,姜玉,汪志平
3follistatin⁃relatedgene3FSTL3tumour⁃associatedmacro⁃
[摘要]目的探究卵泡抑素相关基因(,)对肿瘤相关巨噬细胞(
phagesTAMs2018320213
,)在乳腺癌增殖、迁移和侵袭中的作用及其相关机制。方法收集年月至年月在海军军医大学
21phorbol⁃12⁃myristate⁃13⁃acetatePMA
第一附属医院例乳腺癌患者的肿瘤及其癌旁组织,并提取巨噬细胞。使用佛波酯(,)、
PMA/⁃γinterferon⁃γIFN⁃γPMA/⁃4interleukin⁃4IL⁃4THP⁃1M1M2
干扰素(,)和白细胞介素(,)诱导为初始、型和型巨噬细胞,分
PMAPMA/IFN⁃γPMA/IL⁃4si⁃FSTL3si⁃NCTHP⁃1PMA/IL⁃4
别为组、组、组;采用脂质体转染法将、转染至,再使用诱导转染后
THP⁃1si⁃FSTL3si⁃NCquanlita⁃
的,分别为组、组。采用流式细胞术鉴定巨噬细胞分型。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(
tiverealtimepolymerasechainreactionqRT⁃PCRWesternblottingFSTL3mRNA
,)和检测各组细胞的和蛋白表达情况。收集各
MCF7cellcountingkit8CCK8MCF7
组巨噬细胞上清与购买的乳腺癌细胞系共孵育,通过细胞计数试剂盒(,)检测细胞增殖能
TranswellMCF7TAMsFSTL3
力,使用细胞划痕、实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果与癌旁组织比较,乳腺癌患者的基
<⁃4FSTL3
因表达增加,差异具有统计学意义(P),表型呈型极化。与组相比,组高表达,其上清共孵育
MCF7<⁃NCsi⁃FSTL3M2
的细胞增殖、迁移和侵袭能力增加,差异均具有统计学意义(P)。与组相比,组向型极化能
MCF7<
力减弱,其上清共孵育的细胞的增殖、迁移和侵袭能力减弱,差异具有统计学意义(P)。结论通过正向调
TAMsM2
控向型极化,促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。
3
[关键词]肿瘤相关巨噬细胞;卵泡抑素相关基因;乳腺癌;增殖;迁移;侵袭
.1009-
[中图分类号][文献标志码][DOI]
StudyonthemechanismofFSTL3ontumor⁃associated
macrophagesinbreastcancerproliferation,migration
andinvasion
LyuLingyun,PengYu,LuYaqin,FangHe,ChenYan,JiangYu,WangZhiping
(HealthManagementCenter,AffiliatedHospitalofNavalMedicalUniversity,Shanghai200433,China)
ToexploretheeffectsofFSTL3onthetumor⁃associatedmacrophagesTAMsintheproliferationmi⁃
[Abstract]Objective(),

Methods
breastcancerwhosoughtmedicalcareintheFirstAffiliatedHospitaloftheNavyMedicalUniversityfromMarch2018toMarch
,,
⁃12⁃myristate⁃13⁃acetate
PMAinterferon⁃γIFN⁃γandinterleukin⁃4IL⁃4wereusedtoinduceinitialM1andM2macrophageswhichweredesignated
(),()(),
asthePMAgroupthePMA/IFN⁃γgroupandthePMA/IL⁃⁃FSTL3andsi⁃NCweretransfectedintoTHP⁃1byliposome
,
⁃4wasusedtoinducetransfectedTHP⁃1andassignedrespectivelyasthesi⁃FSTL3groupandthe
,,
si⁃
()
200433
[作者单位]上海,海军军医大学第一附属医院健康管理中心(吕凌云、鲁亚琴、陈艳、汪志平),烧伤外科(彭宇、房贺、姜玉)
*************@
[通信作者]汪志平,电子信箱:

··海军医学杂志年月第卷第期,,,
quantitativerealtimepolymerasechainreactionqRT⁃
()
andco⁃
,
⁃
(),Results,
paredwiththatoftheparacanceroustissuegroupwithstatisticalsignificance<⁃
,(P)
⁃4grouphadhigherexpressionofFSTL3andtheproliferationmigrationandinva⁃
,,,
sionabilitiesofMCF7cellsco⁃incubatedwithitssupernatantincreasedallwithstatisticalsignificance<
,(P)
thatofthesi⁃NCgroupthepolarizationabilitytoM2typeinthesi⁃FSTL3groupweakenedandtheproliferationmigrationandinva⁃
,,,
sionabilitiesofMCF7cellsco⁃incubatedwiththesupernatantofsi⁃FSTL3groupalsoweakenedalsowithstatisticalsignificance<
,(P
⁃
)Conclusion,
izationofTAMstoM2type.
Tumor⁃associatedmacrophageFollistatin⁃like3BreastcancerProliferationMigrationInvasion
[Keywords];;;;;
International
世界卫生组织国际癌症研究机构(在海军军医大学第一附属医院接受切除手术的
AgencyforResearchonCancerIARC202021
,)发布的年例乳腺癌患者的肿瘤及其癌旁组织(距肿瘤边缘
≥3mm
全球癌症数据显示,乳腺癌是目前全球新增发病人)。所有患者均是原发病例,手术前未接受放
1
数最多的癌症[]。在女性人群中,乳腺癌的发病率疗和化疗。该研究方案在海军军医大学第一附属
CH⁃
和死亡率呈现出逐年上升的趋势。控制乳腺癌的医院伦理委员会的监督下获得批准和实施(
EC2017⁃096
发生与发展,成为防治乳腺癌亟待解决的问题。),患者均签署知情同意书。
tumor⁃associatedmacro⁃⁃
肿瘤相关巨噬细胞(主要材料人单核细胞白血病细胞株
phagesTAMs1MCF7
,)是来源于外周血和组织中的巨噬细和人乳腺癌细胞株购自中科院上海细胞
50%2TAMsfetalbovineserumFBSDMEM
胞,占肿瘤质量的[]。乳腺癌患者体内库,胎牛血清(,)、和
RPMI1640Giboco⁃γinter⁃
的积累通常与预后不良、治疗耐药和疾病复发有培养基购自公司,干扰素(
3TAMsferon⁃γIFN⁃γ⁃4interleukin⁃4IL⁃
关[]。是连接炎症和肿瘤的关键细胞,可通过,)、白细胞介素(,
4TRIzolLipofectamine3000Invitro⁃
释放多种细胞因子和基质蛋白酶直接促进肿瘤的)、试剂和TM购自
genRNASYBRGreen
发生、发展和转移,或通过介导肿瘤血管生成和免公司,逆转录试剂盒和试剂
4TAMsPercoll
疫抑制间接促进肿瘤生长[]。已成为癌症治购自上海翌圣公司,分离液、基质胶、佛波酯
phorbol⁃12⁃myristate⁃13⁃acetatePMASigma
疗的重要靶点。(,)购自
3follistatin⁃relatedgene3CCK8
卵泡抑素相关基因(,公司,细胞计数试剂盒试剂购自南京诺维赞
FSTL3TranswellCD14
)是一种致癌基因,编码分泌型糖蛋白,与肿公司,小室购自康宁公司,抗体、
5CD86CD206BDFSTL3
瘤细胞增殖和转移密切相关[]。临床乳腺癌患者的抗体、抗体购自公司,抗体、
FSTL3FSTL33⁃glyceraldehyde⁃3⁃phosphatede⁃
肿瘤上皮细胞中具有高表达,提示可磷酸甘油醛脱氢酶(
hydrogenaseGAPDHProteintech
能参与调控乳腺癌的发生、发展,并可作为乳腺癌,)抗体购自公司,
6FSTL3FSTL3GAPDH
诊断的潜在血浆标志物[]。最近有研究发现,和引物由生工生物工程(上海)股份
bonemorphogeneticpro⁃si⁃FSTL3si⁃si⁃Negative
可通过调控骨形成蛋白(有限公司合成,和阴性对照(
teinBMPM2ControlNCMerck
,)信号通路,促进型巨噬细胞极化,从,)通过公司合成。

而促进肿瘤进展[]。但是否能够直接调控巨方法
⁃137℃5%
噬细胞的促肿瘤功能,还不清楚。本研究旨在评估细胞培养和在,
FSTL3TAMsCODMEMRPMI1640
在乳腺癌患者中的表达,并探索2条件下培养。和培养基中含
%FBSMCF7
是否可通过调控巨噬细胞的极化,促进乳腺链霉素、青霉素和。使用
,DMEMTHP⁃1RPMI1640
癌的发展为将来研究乳腺癌的致病机制和治疗提培养基培养,使用培养基
2d1
供参考。培养,每更换次新鲜培养基。当细胞在其达
70%~90%
1材料与方法到密度,进行细胞传代或实验。

材料原代巨噬细胞的分离及培养将收集的乳
.**********PBS
样本来源收集年月至年月腺癌肿瘤及其癌旁组织转移至培养皿中,使用

海军医学杂志年月第卷第期,,,··
32mg/ml2448
浸泡并洗涤次。将组织剪成细小碎块,加入夜,待细胞完全贴壁后。分别继续培养、和
Ⅳ
的型胶原蛋白酶和透明质酸酶重悬。根据检测试剂说明进行细胞增殖实
37℃180r/min450nm
组织,并转移至离心管。,恒温消化验,使用酶标仪检测波长下的吸光值。

,每吹打次。消化所得细胞悬液过细胞侵袭实验在小室()中铺上
40μm2000r/min5minDMEM24
筛网,收集滤过夜,离心。基质胶,小室浸没在含培养基的孔板中。
PBSpercollMCF73×10/ml
使用重悬细胞,利用法分离巨噬细胞。将各组按5个数量接种至小室中。
24h
吸取中间白色层巨噬细胞,用于后续实验。在细胞培养箱中培养。取出小室置于室温,使
⁃γPMA/IL⁃4THP⁃14%%
和诱导细胞用的多聚甲醛固定,再用结晶紫
THP⁃13×10/ml620minPBS2
将细胞按5个数量铺至孔板内。染色,最后用洗涤次后在显微镜下拍
50ng/mlPMA24h10
加入含终浓度的培养基诱导照并计数,随机取个视野,取平均数,每组重
PBS6
后,获得初始巨噬细胞。弃培养液,清洗细胞。复次。
20ng/mlIFN⁃γ20ng/mlIL⁃×10/ml
分别加入含终浓度和细胞划痕实验将按5个数
48hM1M26
的培养基诱导,使细胞分化为型和型量接种至孔板中,细胞培养箱中培养过夜,待细
巨噬细胞。胞完全贴壁后。用枪头尖端在各组细胞上进行垂
⁃13×10/mlPBS2
细胞转染将按5个直划痕。使用洗涤细胞次,在显微镜下拍照
624hImage
数量接种至孔板中,在细胞培养箱中培养过夜。记录。继续培养后再次拍照记录,通过
Lipofectamine3000si⁃FSTL3J6
按照TM转染试剂说明将软件进行距离测量,每组重复次。
si⁃NCTHP⁃
和转染至中。更换新鲜培养基后继续实时荧光定量聚合酶链式反应法按照
2dRNARNA
培养,进行后续实验。提取试剂说明书方法提取各组细胞,使
⁃1THP⁃1MCF7RNAcDNA
细胞分组以及和细胞用反转录试剂盒将反转录成。随后使
THP⁃15PMAPMA/SYBRGreen
共孵育将细胞分为组:使用、用进行实时荧光定量聚合酶链式反应
IFN⁃γPMA/IL⁃4THP⁃1M1M2qualitativerealtimepolymerasechainreationqRT⁃
和诱导为初始、型和(,
PMAPMA/IFN⁃γPMA/PCR)FSTL35⁃GTGCCTCCGGCAA⁃
型巨噬细胞,分别为组、组、。上游引物:’
IL⁃4si⁃FSTL3si⁃NCCATTGA⁃35⁃GCACGAATCTTTG⁃
组;采用脂质体转染法将、转染’下游引物:’
THP⁃1PMA/IL⁃4THP⁃1CAGGGA-3'GAPDH5⁃AGGTCGGT⁃
至,再使用诱导转染后的,;上游引物:’
si⁃FSTL3si⁃NCGTGAACGGATTTG⁃35⁃TGTAGAC⁃
分别为组、组。’,下游引物:’
MCF73×10/ml6CATGTAGTTGAGGTCA⁃395℃
将按5个接种至孔板中,细胞。反应条件:预变性
1min95℃20s60℃1min72℃5min40
培养箱中培养过夜,待细胞完全贴壁后,分别加入;,;延伸,共
12hMCF7GAPDH2ΔΔCT
各组巨噬细胞上清继续孵育。孵育后的个循环。为内参基因,采用-法计算
FSTL33
细胞用于后续实验。的相对表达量,实验重复次。

流式细胞术检测巨噬细胞分型收集各组法在各组细胞中加入
PBS2RIPA
巨噬细胞,洗涤细胞次。随后利用不同荧裂解液(含蛋白酶抑制剂)裂解细胞,离心收
CD14CD86CD206BCA
光标记的抗体、抗体、抗体在集上清液。通过法测定上清液的蛋白浓度,按
4℃40min30μg/SDS⁃PAGE
孵育,染色后细胞重悬在流式细胞分析孔进行凝胶电泳。随后依次进行
flowcytometrystainingFCSbuffer4℃12h2
染色液(,)中进行转膜、抗原封闭、一抗孵育(,)。第天加入

上机检测。使用软件进行流式数据荧光二抗孵育,最后加入曝光液在凝胶成像仪下拍
forwardscatterFSCFSTL311000GAPDH1
分析,用前向角散射(,)和侧向照。一抗稀释比例:(∶)、(∶
sidescatterSSC3000
角散色(,)设门圈出活细胞群,通)。

过设门圈出巨噬细胞群;通过设门圈统计学处理

出型巨噬细胞;通过设门圈出型采用统计学软件进行数据分析。计
ˉ±Students
巨噬细胞。量资料以xs表示,组间单因素比较使用’
×10two⁃wayANOVA
细胞增殖实验将各组细胞按4t检验分析,双因素比较使用分析。
/ml96<
个数量接种于孔板中,细胞培养箱中培养过P表示差异有统计学意义。

··海军医学杂志年月第卷第期,,,
MCF7CCK8
2结果细胞上清与细胞共孵育,采用检测

乳腺癌分型和表达量检测细胞、、的增殖情况。结果显示与
PMAPMA/IL⁃4
采用流式细胞术检测乳腺癌肿瘤及其癌旁组组相比,组细胞的增殖能力增加,在
CD20672h<
织中巨噬细胞分型,结果显示肿瘤组织中阳时差异具有统计学意义(P)。见表。说
TAMs
性的巨噬细胞比例高于癌旁组织,两者比较差异具明上清能够促进乳腺癌细胞增殖。
<
有统计学意义(P),而阳性的巨噬细胞
1表3诱导THP⁃1为M1及M2型巨噬细胞鉴定
比例与癌旁组织相比无明显差异。见表。说明乳ˉ
TAMsM2qRT⁃PCR(%,x±s,平行样例数n=3)
腺癌呈型极化。结果显示肿瘤CD86CD206
TAMsFSTL3mRNA组别
±±
<
组织,差异具有统计学意义(P),说明乳腺癌PMA/IFN⁃±±
TAMsFSTL32组
PMA/IL⁃±±
高表达。见表。组
PMAa<⁃γ⁃γIL⁃4
注:与组比较P;为干扰素,为白细胞
表1乳腺癌及其癌旁组织中TAMs分型检测⁃4PMA
ˉ介素,为佛波酯
(%,x±s,平行样例数n=3)
CD86CD206
组织
±±
肿瘤组织
±±
癌旁组织
a<
注:与癌旁组织比较P
IFN⁃γ⁃γIL⁃4⁃4PMA
表2乳腺癌及其癌旁组织中FSTL3的mRNA水平注:为干扰素,为白细胞介素,为佛波酯
ˉFSTL3GAPDH3⁃
(x±s,平行样例数n=3)为卵泡抑素相关基因,为磷酸甘油醛脱氢酶
FSTL3mRNA
组织图1M1型和M2型巨噬细胞中FSTL3蛋白水平检测
±
肿瘤组织
±
癌旁组织ˉ
a<(x±s,平行样例数n=3)
注:与癌旁组织比较P;为卵泡抑素相关基因
FSTL3mRNAFSTL3
组别蛋白
⁃γPMA/IL⁃4THP⁃±±
和诱导分型鉴组
FSTL3PMA/IFN-±±
定和表达量检测组
PMAPMA/IFN⁃γPMA/IL⁃4PMA/IL-±±
对、和诱导后的组
PMAa<⁃γ⁃γIL⁃4
THP⁃1注:与组比较P;为干扰素,为白细胞
巨噬细胞进行细胞分型鉴定,流式细胞术结⁃4PMAFSTL33GAPDH
PMAPMA/IFN⁃γCD86介素,为佛波酯,为卵泡抑素相关基因,为
果显示,与组相比,组阳性3⁃
<
细胞的比例增加,差异具有统计学意义(P)。
PMAPMA/IL⁃4CD206
与组相比,组阳性细胞的比表5M2型巨噬细胞对MCF7细胞增殖能力的影响
<
例增加,差异具有统计学意义(P)。见表。(x±s,平行样例数n=3)
PMA/IFN⁃γPMA/IL⁃4THP⁃124h48h72h
说明和分别诱导为组别
M1M2qRT⁃±±±
和型巨噬细胞成功。和组
PMA/IL-±±±
blotPMAPMA/IL⁃4组
结果显示与组相比,⁃4⁃4PMA
FSTL3mRNA注:与组比较P<;为白细胞介素,为佛
和蛋白表达水平增加,差异具有统计
<⁃γ波酯
学意义(P),而组和组间比
>
较差异无统计学意义(P)。见表、图。说促进细胞迁移和侵袭
PMA/IL⁃4M2THP⁃1PMAPMA/IL⁃4THP⁃1
明诱导后的型巨噬细胞收集和诱导后的巨噬
FSTL3TAMsMCF7Transwell
表达水平增加,与乳腺癌表型更为接细胞上清与细胞共孵育,通过实验
MCF7
近,因此选择此组细胞进行后续研究。检测对细胞侵袭能力的影响。结果显示与
⁃4
促进细胞增殖组相比,组细胞侵袭能力增加,差异
PMAPMA/IL⁃4THP⁃1<
收集和诱导后的巨噬具有统计学意义(P)。见图、表。采用

海军医学杂志年月第卷第期,,,··
MCF7
细胞划痕检测对细胞迁移能力的影响。结果
PMAPMA/IL⁃424h
显示与组相比,组细胞内相对
<
迁移能力增强,差异具有统计学意义(P)。
2B6TAMs
见图、表。说明上清能够促进乳腺癌细
胞迁移和侵袭。
FSTL33GAPDH3⁃
注:为卵泡抑素相关基因,为磷酸甘油醛脱
氢酶
图3沉默FSTL3对TAMs中FSTL3
蛋白表达水平的影响
表7沉默FSTL3的mRNA和蛋白表达
ˉ
(x±s,平行样例数n=3)
FSTL3mRNAFSTL3
组别蛋白
si⁃±±
组
si⁃±±
组
si⁃NCa<
注:与组相比P;为卵泡抑素相关基因,
GAPDH3⁃
为磷酸甘油醛脱氢酶
表8沉默FSTL3对TAMs极化影响
ˉ
(%,x±s,平行样例数n=3)
CD86CD206
组别
si⁃±±
ABIL⁃4⁃组
注:为细胞侵袭实验,为细胞划痕实验;为白细胞介素si⁃±±
4PMA组
,为佛波酯si⁃NCa<
注:与组相比P;为卵泡抑素相关基因,
图2M2型巨噬细胞对MCF7细胞侵袭和迁移能力的影响TAMs
为肿瘤相关巨噬细胞

ˉ沉默拮抗对细胞的促增
(x±s,平行样例数n=6)
%殖作用
组别侵袭细胞数(个)相对迁移率()si⁃NCsi⁃FSTL3MCF7
PMA143±±
组CCK8MCF7244872h
PMA/IL-4248±±,采用检测细胞、、的
组si⁃NCsi⁃FSTL3
-4-4PMA增殖情况。结果显示与组相比,组
注:与组比较P<;为白细胞介素,为佛波酯72h
细胞的增殖能力减弱,在时差异具有统计学意
<
沉默对极化影响义(P)。见表。说明沉默有效拮抗
si⁃NCsi⁃FSTL3THP⁃1TAMsMCF7
使用和分别转染细胞促进细胞增殖的能力。
PMA/IL⁃4qRT⁃PCR
后,再使用进行诱导,通过和
WesternblottingFSTL3mRNA
检测的和蛋白表达表9沉默FSTL3对TAMs促MCF7细胞增殖作用中的
si⁃NCsi⁃FSTL3ˉ
水平。结果显示与组相比,组细胞影响(x±s,平行样例数n=3)
24h48h72h
FSTL3mRNA组别
的和蛋白表达水平降低,±±±
<
计学意义(P)。见图、表。说明沉默PMA/IL⁃±±±
FSTL3PMA/IL⁃4TAMsFSTL3组
有效拮抗诱导的表si⁃⁃4⁃4PMA
si⁃NCsi⁃注:与组相比P<;为白细胞介素,为佛
达水平增加。通过流式细胞术检测组和FSTL33
FSTL3si⁃NC波酯,为卵泡抑素相关基因
组巨噬细胞分型,结果显示与组相比,
si⁃
组阳性细胞的比例减少,差异具有沉默拮抗对细胞的促迁
<
统计学意义(P),而组间阳性细胞的移和侵袭作用
8FSTL3si⁃NCsi⁃FSTL3MCF7
比例无明显差异。见表。说明沉默有效拮收集组和组上清与细胞
PMA/IL⁃4THP⁃1M2TAMsTranswellMCF7
抗诱导向型极化。共孵育,通过实验检测对细胞侵袭

··海军医学杂志年月第卷第期,,,
si⁃NCsi⁃FSTL3
能力的影响。结果显示与组相比,现,在乳腺癌的肿瘤微环境中,乳腺癌细胞分泌因
<M2Li12
组细胞侵袭数量减少,差异具有统计学意义(P子调节巨噬细胞向型分化。等[]发现,通过

)。见图、表。采用细胞划痕检测对抑制的数量来重塑免疫抑制性肿瘤微环境
MCF7si⁃NCtumormicroenvirmmentTME
细胞迁移能力的影响。结果显示与组(,),能够抑制乳腺癌的
si⁃FSTL324hMu13
相比,组细胞内相对迁移能力减弱,免疫逃逸和转移。等[]的研究表明,乳酸可以
</
差异具有统计学意义(P