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梅花鹿茸不同生长时期转录组及蛋白组联合分析.pdf


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DOI:.
梅花鹿茸不同生长时期转录组及蛋白组联合分析
慧 芳,孙天霞,薛东明,姜英男,赵 雨*
(长春中医药大学人参科学研究院,长春 130117)
  摘要:目的 了解鹿茸再生及快速生长过程中基因和蛋白的动态变化,阐明鹿茸生长发育机制。方法 以梅
花鹿(CervusnipponTemminck)的鹿茸[初生期(PS)、快速生长期(RG)、骨化期(OS)鹿茸组织]作为实
验材料,基于IlluminaHiseq和iTRAQ技术在转录和蛋白水平进行分析,根据差异基因和差异蛋白结果筛选与鹿
茸再生和快速生长有关的基因和蛋白。结果 2组分别得到11294(PSvsRG)和4924(PSvsOS)个显著差异基因
(DEGs),2组的蛋白组数据显示,分别得到236、211个差异蛋白(DAPs),相关性分析显示转录组和蛋白组
数据相关性分析呈弱相关。在2组中分别有54、51个DEGs编码了其相应的DAPs,其中,在2组中分别得到35
和20个在转录组和蛋白组中调节方向相同的DEGs和相应的DAPs。对候选基因/蛋白进行KEGG富集分析,分
别富集到10和12个信号通路。其中,2组共同富集到的通路包括:血管平滑肌收缩、p53信号通路、黏着斑、蛋
白质消化吸收、TGF-β信号通路、ECM-受体相互作用信号通路。只富集到快速生长期的信号通路包括:戊糖磷
酸途径、糖酵解/糖异生、果糖和甘露糖代谢及代谢途径。只富集到骨化期的信号通路包括:破骨细胞分化、肌
动蛋白细胞骨架的调节、紧密连接、RNA转运、mRNA监测途径信号通路。共有10个候选基因/蛋白(CALD1、
THBS2S、COL9A、ALDO、COL1A、HSPG2、SIRPA、CSRP、MYH9、H1-5)注释到上述信号通路。结论 在
鹿茸生长发育期间许多基因和蛋白质在鹿茸快速生长期和骨化期表现出不同的丰度。转录组和蛋白组数据相关性
较差。筛选出与鹿茸生长发育相关的蛋白为:CALD1、THBS2S、COL9A、ALDO、COL1A、HSPG2、SIRPA、
CSRP、MYH9、H1-5以上结果为阐明鹿茸再生的分子机制提供了重要的理论依据。
  关键词:梅花鹿;转录组测序;蛋白组;iTRAQ定量分析技术;鹿茸再生
中图分类号::A 文章编号:1003-5699(2022)08-0975-05
JointanalysisoftranscriptomeandproteomeofCervusnipponTemminckantlerindifferent
periods
HUIFang,SUNTianxia,XUEDongming,JIANGYingnan,ZHAOYu*
(JilinGinsengAcademy,ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130117,China)
  Abstract:ObjectiveTounderstandthedynamicchangesofgenesandproteinsintheprocessofantler
regenerationandrapidgrowth,
tissuesofCervusnipponTemminckintheprimarystage(PS),therapidgrowthstage(RG)andtheossificationstage
(OS)wereanalyzedasexperimentalmaterialsatthetranscriptionandproteinlevelsbasedontheIlluminaHiseqand

(PS
vsRG)and4924(PSvsOS)differentiallyexpressedgenes(DEGs),
基金项目:国家重点研发计划(2018YFC1706603)
作者简介:慧 芳(1994—),女,博士研究生,主要从事中药化学方向研究
*通信作者:赵雨,电子信箱-******@
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groupsshowedthat236and211differentialabundanceproteins(DAPs)wereobtained,
,54and51DEGs
encodedtheircorrespondingDAPs,respectively,amongwhich35and20DEGsandcorrespondingDAPswiththe
sameregulatorydirectioninthetranscriptomeandproteomewereobtainedinthetwogroups,
enrichmentanalysiswasperformedoncandidategenes/proteins,and10and12signalingpathwayswereenriched,
,thepathwayscommonlyenrichedinthetwogroupsincluded:vascularsmoothmuscle
contraction,p53signalingpathway,focaladhesion,proteindigestionandabsorption,TGF-βsignalingpathway,and
ECM-:
pentosephosphatepathway,glycolysis/gluconeogenesis,fructoseandmannosemetabolismandmetabolicpathways.
Signalingpathwaysenrichedonlyintheossificationstageincluded:osteoclastdifferentiation,regulationoftheactin
cytoskeleton,tightjunctions,RNAtransport,
(CALD1,THBS2S,COL9A,ALDO,COL1A,HSPG2,SIRPA,CSRP,MYH9,H1-5)wereannotatedtotheabove
,manygenesandproteinsshow

:CALD1,THBS2S,
COL9A,ALDO,COL1A,HSPG2,SIRPA,CSRP,MYH9,H1-
basisforelucidatingthemolecularmechanismondeerantlerregeneration.
  Keywords:CervusnipponTemminck;transcriptomesequencing;proteome;iTRAQquantitativeanalysis
technology;deerantlerregeneration
梅花鹿茸系鹿科动物梅花鹿(Cervusnippon子(EGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)通过促进鹿
Temminck)雄性未骨化带有密生茸毛的幼角,也是独茸细胞的增殖分裂,调控鹿茸的生长速度[12-16]。一些
特的哺乳动物的附属肢体[1]。鹿茸的生长速度非常快,转录因子也参与到了鹿茸软骨内骨化过程,如cAMP
是唯一一个每年都会脱落后能完全再生的哺乳动物器反应元件结合蛋白、Sox家族、活化蛋白-1、Runx2转
官[2]。录因子、C-myc转录因子[17-20]。鹿茸生长发育过程中
鹿茸再生的组织基础为生茸区骨膜(antlerogenic还伴随着神经和血管的快速生长,神经生长因子参与
periosteum,AP),AP衍生出角柄骨膜(pedicle了鹿茸神经的生长,具有促进鹿茸的神经元生长、发育、
periosteum,PP),而鹿茸的生长中心则是由角柄骨膜再生的作用[21-22]。成纤维生长因子和血管生成素通过
细胞发育而来的[3-4]。鹿茸在脱盘后开始生长,生长速激发鹿茸血管生成参与到鹿茸快速生长期和骨化期的
度逐渐加快。在60d后,由于生茸区的骨膜中的间充调控。
质干细胞的周期性被激活,鹿茸进入了快速生长期[4-5],由此可看出,鹿茸具有独特生物学特性,且调控
90d后,鹿茸进入了快速骨化期,经历了软骨内骨化机制复杂。虽然对鹿茸生长发育的组织学研究已有较
过程[6]。好的基础,但其具体分子机制还未阐明,生长发育相
研究表明,有很多因素如激素、细胞因子、转录关的关键蛋白和信号调控网络也不清晰。随着组学技
因子都参与到鹿茸生长发育过程的调控。其中主要调术的发展,研究者可获得大量的数据,通过对组学数
控快速生长及骨化的激素为雄激素,除了雄激素外,据的挖掘,进行更深入的机制研究。特别是利用各个
甲状腺激素[7]、甲状旁腺素[8]、卵泡刺激素、黄体生成素、组学数据之间的互补性和相似性,综合分析多组学数
肾上腺皮质激素、催乳素、雌二醇、孕激素、视黄酸[9]、据,可以进行更加全面、系统的阐明鹿茸生长发育的
绒毛膜促性腺激素[10]、褪黑激素[11]等也在鹿茸生长发机制。
育过程中起重要的调节作用。本研究采用IlluminaHiSeq测序技术和iTRAQ技
除激素调控外,多种细胞因子也参与鹿茸生长发术,对处于初生期、快速生长期和骨化期鹿茸顶端组
育过程,如胰岛素样生长因子(IGF-1)、表皮生长因织进行转录组和蛋白组测序并进行联合分析,以期为
·977·
鹿茸生长发育机制的研究提供依据。较多(图1)。
1材料PSvsRG组共得到236个差异蛋白(DAPs);其
本研究选取4岁龄健康的东北梅花鹿茸顶端组织中138个上调蛋白,98个下调蛋白。PSvsOS组共获得
为研究对象,鹿茸样品采集于吉林省双阳市鹿乡镇。211个DAPs,其中,有121个上调蛋白,90个下调蛋
分别采集初生期、快速生长期和骨化期鹿茸的顶端组白(图1)。这些结果表明,许多蛋白质在鹿茸快速生
织,每个时期随机选取3只进行取样。长期和骨化期表现出不同的丰度(图1)。

,发现在PSvsRG和PSvsOS组中,分别有
RNA。通过NanoDrop2000和琼脂糖凝胶电泳检测54、51个DEGs编码了其相应的DAPs(图2)。所以
RNA的质量后,用DNaseI消化DNA后,用带有为了分析鹿茸生长过程中转录组和蛋白质组变化之间
Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA;将mRNA的一致性,本研究使用筛选出的54和51个DGEs及
打断成短片段,以打断后的mRNA为模板,合成一链其相应的DAPs的数据进行了相关性分析(图3,图
cDNA,然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA,4)。Pearson相关性检验表明,在PSvsRG中,DEGs
并使用试剂盒纯化回收、粘性末端修复、cDNA的与相应DAPs的Log2foldchange呈正相关,皮尔森系
3’末端加上碱基“A”并连接接头,(图3);在PSvsOS中,DEGs及其相应的
选,最后进行PCR扩增;构建好的文库用Agilent2100DAPs的Log2foldchange呈负相关,皮尔森系数为-
Bioanalyzer和ABIStepOnePlusReal-TimePCRSystem质(图4)。结果显示,转录组和蛋白组相关性较差,
检合格后,上机测序。呈弱相关。这可能是由于转录水平的波动比蛋白质的
[23]翻译和修饰过程的波动更快。
(FragmentPerKilobasesperMillionreads)计算基因的
表达量。按照AudicS[24]等方法进行差异基因的筛选,
进行多重假设检验校正,控制整体的错误发生率。

鉴定和定量,不同样本之间对差异蛋白的定义为:当
,
时,视为差异蛋白。图1鹿茸中表达有差异表达的基因和蛋白质

检验,找出与所有基因组和蛋白质背景相比,在差异
基因和差异蛋白中显著性富集的Pathway。根据公式计
算出差异基因和蛋白的P值,以P-value≤
值,满足此条件的定义为在差异蛋白质中显著富集的
Pathway。
图差异蛋白和差异基因的维恩图

白组的差异基因和差异蛋白进行相关性分析。
3结果

基因定义为FDR≤
因。PSvsRG组共得到11294个显著差异基因(DEGs),
其中7954个基因显著上调,3340个基因显著下调;
PSvsOS组共有4924个DEGs,其中2402个基因显著
上调,2522个基因显著下调。结果显示鹿茸不同生长
时期有大量差异基因表达,且在快速生长期差异基因图3PSvsRG组中DEGs和DAPs转录水平与蛋白丰度的相关性
·978·
除了共同富集到的信号通路和基因/蛋白外,在
快速生长期还富集到了戊糖磷酸途径、糖酵解/糖异生、
果糖和甘露糖代谢、代谢途径等通路。其中,有3个
基因/蛋白只在快速生长期表达,它们是ALDO(下调)、
COL1A(上调)、HSPG2(上调)。
在骨化期富集还到了破骨细胞分化、肌动蛋白细
胞骨架的调节、紧密连接、RNA转运、mRNA监测途
径信号通路。其中有4个基因/蛋白只在骨化期表达,
图4PSvsOS组中DEGs和DAPs转录水平与蛋白丰度的包括:SIRPA(上调),显著下调基因包括:CSRP(下
相关性调)、MYH9(下调)、H1-5(下调)。

速生长期在转录和蛋白水平调节方向相反的基因和蛋与低级脊椎动物和无脊椎动物相比,哺乳动物的
白后,获得了35个DEGs及其相应的DAPs,其中,再生能力非常有限,而鹿茸是一种可以周期性完全再
上调基因/蛋白有27个;下调基因/蛋白有8个。去生的器官,而鹿茸再生的调控机制不甚清晰,如果可
掉骨化期在转录和蛋白水平调节方向相反的基因和蛋以阐明鹿茸再生过程的分子调节机制,对于肢体再生、
白后,获得20个基因和蛋白。其中,发现上调的基因器官移植及骨病治疗有着重要意义。
/蛋白6个,下调基因/蛋白14个。本研究结果显示,粘着斑、ECM-受体相互作用、
在鹿茸快速生长期和骨化期有3个基因/蛋白一TGF-β信号通路、p53信号通路、血管平滑肌收缩、蛋
直处于上调状态,它们包括:Ⅰ型角蛋白(KRT1)、白质消化吸收通路共同参与到了鹿茸快速生长和骨化
IX型胶原(COL9A)、凝血酶敏感蛋白2(THBS2S)。期的调控。
还有4个基因/蛋白呈下调趋势,它们包括:组蛋白在鹿茸快速生长期,产生了高强度的机械张力使
H4(H4)、组蛋白H2A(H2A)、钙调结合蛋白(CALD1)。鹿茸血管、皮肤和神经快速生长,骨化期涉及到软骨
除了在2个时期共同富集到基因的外,本研究还关注内成骨和膜内成骨过程。而本研究中共同富集两个时
了只在快速生长期或骨化期表达的基因,其中,在快期的基因/蛋白(THBS2S、CALD1、COL9A)参与了
速生长期上调基因包括:I型胶原蛋白α链(COL1A)、鹿茸组织细胞内的信号传递、细胞增殖、成骨分化和
软骨可聚蛋白多糖(AGC1)、基底膜特异性硫酸乙血管生成等过程。
酰肝素蛋白聚糖核心蛋白(HSPG2)等。显著下调基除了共同富集到的信号通路和基因/蛋白外。本
因为果糖-二磷酸醛缩酶(ALDO)。在骨化期显著上研究还发现了只在快速生长期和骨化期表达的基因/
调基因包括为信号调节蛋白(SIRPA),显著下调基蛋白。
因包括:富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白质(CSRP)、在快速生长期富集到了与糖代谢(ALDO)和细
肌球蛋白重链9(MYH9)、肽酰脯氨基顺反异构酶B胞外基质(ECM)的相关蛋白(HSPG2)。研究显示,
(PPIB)、组蛋白H1/5(H1-5)。在软骨发育过程中,信号分子严格调控葡萄糖的吸收
。糖代谢的紊乱会影响软骨细胞的成熟过程[25]。
和骨化期候选基因/蛋白进行KEGG富集分析,结果ECM由结构性和功能性大分子化合物组成,包括胶原
显示,在快速生长期候选基因/蛋白中有共有7个基蛋白、弹性蛋白、糖***聚糖、蛋白聚糖、非胶原糖蛋白[26]。
因/蛋白注释到了10个信号通路。骨化期候选基因/在骨骼中,ECM介导细胞粘附,机械传导,矿化成核
蛋白有7个基因/蛋白富集到12个通路。其中,2个等过程。在本研究中发现,有胶原蛋白、蛋白聚糖的
时期共同富集到6个信号通路,包括:粘着斑、ECM-表达。我们认为在鹿茸生长发育中糖代谢及ECM通
受体相互作用、TGF-β信号通路、p53信号通路、血管路具有重要作用,可能通过激活胞内信号传递的连锁
平滑肌收缩、蛋白质消化吸收通路。而共同富集到以反应从而调控着多种与鹿茸生长发育有关的信号通路。
上6个信号通路的基因/蛋白为CALD1、THBS2S、在骨化期富集到的基因/蛋白主要与破骨细胞分
COL9A。化和细胞骨架调节(SIRPA、CSRP、MYH9、H1-5)
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有关,这些蛋白可能通过调节破骨细胞活性或激活成织工程研究与临床康复,2007,11(37):7373-7376.
骨分化相关通路参与了鹿茸的成骨过程。[13]SADIGHIM,HAINESSR,SKOTTNERA,
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之间的相似性和互补性更深层次的从多角度、多层次、[15]褚文辉,王大涛,鲁晓萍,
究模型鹿茸中国组织工程研究
系统地阐明鹿茸再生和快速生长发育机制。本研究以-[J].,2013,17(45):7961-
7967.
不同生长时期鹿茸为样品,对其进行转录组和蛋白组
[16]-β家族及其受体在梅花鹿茸角中的表达与
测序,筛选出与鹿茸生长发育相关的基因及蛋白质,调节[D].长春:吉林大学,2011.
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