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b型流感嗜血杆菌结合疫苗
b Xing Liuganshixueganjun Jiehe Yimiao
Haemophilus Influenzae Type b Conjugate ine
本品系用纯化的b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖(Capsular haride,CPS)抗原,通过己二酰肼(ADH)与破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)蛋白共价结合制成。用于预防b型流感嗜血杆菌引起儿童的感染性疾病,如脑膜炎、肺炎等。
1 基本要求
生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造
菌种
生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
菌种名称及来源
58534菌株,来源于中国药品生物制品检定所。
种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
种子批的传代
主种子批启开后传代次数不超过5代,工作种子批启开后至接种发酵罐培养传代次数不得超过5代。
种子批菌种的检定
检定菌种可用含羊血的巧克力培养基或Hib综合培养基。

b型流感嗜血杆菌菌种在普通营养琼脂培养基上不生长,在含羊血的巧克力培养基或在Hib综合琼脂培养基上生长,生长需要X因子(氯化血红素)、V因子(β辅酶A);卫星试验阳性,菌落形状灰白色、半透明、光滑凸起,湿润,边缘规则。

应为革兰氏阴性短小杆菌、有荚膜,有时连成线状,亦可有单个阴性球菌。
生化反应
发酵葡萄糖、木糖、半乳糖,产酸不产气。不发酵蔗糖、乳糖和果糖。赖氨酸脱羧酶反应呈阴性。

将在35~37℃培养的菌苔,与Hib免疫血清进行玻片凝集试验,应有强凝集反应。
种子批的保存
种子批应冻干后保存于8℃以下。
原液
生产用种子
启开工作种子批菌种,接种在液体或固体Hib综合培养基上,制备数量适宜的生产用种子。

采用Hib综合培养基。不得含有对人体有害或其他过敏原物质。

采用培养罐液体培养,在培养过程中取样进行纯菌试验、涂片革兰氏染色镜检,如发现污染杂菌,应废弃。

于对数生长的后期或静止期的前期终止培养,取样进行菌液浓度测定及纯菌检查,然后于培养物中加入适宜浓度的甲醛溶液或脱氧胆酸钠溶液杀菌,以确保杀菌完全及不损伤Hib荚膜多糖为宜。
多糖提取和纯化
,离心去菌体后收集上清液,采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀收集复合多糖,乙醇沉淀收集粗制多糖,或超滤浓缩后乙醇沉淀,取上清,然后加入适宜浓度的乙醇溶液沉淀多糖,并依次用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物,干燥后即为粗制多糖,-20℃或以下保存。
将粗制多糖溶解于1/10饱和醋酸钠溶液中,然后按适当比例用冷酚溶液重复抽提数次。收集上清液,并透析或超滤脱酚,再加乙醇至最终浓度为60%-80%,离心后收集沉淀物,或超滤浓缩后乙醇沉淀,取上清,然后加入60%-80%的乙醇溶液沉淀多糖,依次用无水乙醇、丙酮于离心洗涤,真空干燥,所得固体即为精制多糖。
多糖检定
。
保存及有效期
保存于-20℃或以下,保存时间按批准的执行。

,按适宜比例加入溴化氰进行活化,然后向反应液中加入适宜浓度的己二酰肼溶液,反应过夜。再将反应液超滤或透析。可冻干收集固体衍生物。
多糖衍生物检定
。
保存及有效期
保存于-20℃或以下,保存时间不超过30天。
载体蛋白
载体蛋白为破伤风类毒素。破伤风类毒素原液制造和检定应符合“吸附破伤风疫苗”-。
可采用柱色谱或其他经批准的方法对破伤风类毒素原液进一步纯化,并配制至适宜浓度。
多糖蛋白结合物的制备

多糖衍生物与破伤风类毒素蛋白等量混合,加入碳二亚胺(EDAC)进行反应。然后透析或超滤透析。

结合物用柱色谱纯化,收集Vo附近的洗脱液,合并各次层析收获的洗脱液即为纯化的结合物,除菌过滤后,即为结合物原液。
原液检定
。
保存及有效期
保存于2~8℃,保存时间不超过6个月。
半成品
配制
用氯化钠注射液稀释多糖结合物原液,每1毫升疫苗溶液含Hib荚膜多糖应不低于20µg。
半成品