细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤.pdf

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1)爬片可用一般的盖玻片,也可用专用爬片;用盖玻片时,可根据自己的需要
用小砂轮或玻璃刀剪裁成合适的大小,以备置于6孔板、12孔板或24孔板;
2)将剪裁好的爬片,置于浓硫酸中浸泡过夜,第二天先用自来水冲洗20遍,
然后置于无水酒清中浸泡6小时,再用三蒸水冲洗3遍,放在饭盒或者玻璃
培养皿中烘干后高压消毒。高压消毒后取出放入烘箱中烘干,烘干后可放入
超净台中备用。
3)可将爬片用多聚赖氨酸处理,以使细胞与爬片结合更牢固。1mg/ml的多聚赖
氨酸用的滤器过滤除菌后分装于经过无菌处理的1ml细胞冻存管内保存在4℃
里,三个月内仍然可以使用。用时将高压灭菌过的爬片放到ml的多聚赖氨
酸溶液内浸泡5min,无菌晾干即可(放入培养板孔内注意爬片的正反面)。
或将爬片铺于培养皿中,将多聚赖氨酸溶液滴于爬片上,室温10分钟后,
吸除玻片上的溶液,在超静台内晾干后使用。储存、稀释和吸取多聚赖氨酸
要使用塑料制品。

1)胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中,充分吹打,使之成单细胞悬液,
计数。
2)根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内。滴加细胞悬液时,根据
爬片的大小,先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基,然后将爬片置
于液滴上,压紧,使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起,防止加细胞
悬液时爬片漂起,造成双层细胞贴片。若细胞贴壁能力不强,爬片可经多聚
赖氨酸浸片后放入。

1)在培养板中培养好细胞后,吸除培养基,一般先使用PBS轻洗细胞2×3min,
然后再做固定(凋亡的TUNEL染色等可以不清洗)。
2)固定:加入4%多聚甲醛(PBS配制)固定20分钟。如果暂时不能立即做组化
检测,使用含%多聚甲醛的PBS浸泡细胞(注意在免疫组化检测完成前不要
让细胞变干,否则细胞收缩形态不好)。
3)除去多聚甲醛,使用PBS轻洗细胞3×3min。
4)通透:%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略
此步骤)。
5)除去TritonX-100,使用PBS轻洗细胞3×3min。
6)内源性过氧化物酶处理:3%H2O2孵育15min(选作,二抗连HRP必需做,
其他的如做免疫荧光染色不用做)。
7)除去H2O2,使用PBS轻洗细胞3×3min。
8)封闭:用10%的与二抗同源的血清(PBS配制)封闭半小时。封闭结束后千万
不要洗,直接上一抗。
9)一抗:滴加足够量适宜浓度的一抗,4℃孵育过夜(或37℃,60min);若有
两种一抗(要是不同种属的)则同时孵育,两种二抗亦同时孵育(二抗同时
使用时最好是同一种属)。
10)除去一抗,使用PBS轻洗细胞3×3min。
11)二抗:滴加足够量适宜浓度的二抗,37℃,30min(从加荧光二抗起,后面
所有操作步骤都尽量在较暗处进行)。
12)除去二抗,使用PBS轻洗细胞3×3min。
13)二氨基联苯***(DAB)底物显色:室温下避光孵育5至10分钟,或直至样本
出现棕褐色(选作,二抗连得是酶的必做,显色时间严格控制,要避免显色
过度引起假阳性;二抗连的是荧光素的不用做)。
14)除去显色工作液,使用PBS冲洗细胞3~4次。
15)复染核:mlDAPI(或200nMHoechst33342)避光孵育5min。
16)使用PBS轻洗细胞4×5min,洗去多余的DAPI。
17)取爬片时由于爬片与培养皿底结合较紧,张力较大,可将注射器针头针尖向
背面做个小钩,这样将爬片轻轻勾起,用小镊子取出即可。
18)用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,然后在荧光
显微镜下观察并采集图像。
19)保存细胞爬片的时候,先在培养皿底放一层面巾纸,然后再放爬片,这样方
便实验时取片。并在盖子上做标记,一般-20℃可保存2-3个月。