借助荧光测定核酸的方法.docx

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专利名称::借助荧光测定核酸的方法
技术领域:
:本发明涉及用于测定存在于样品中的核酸的量的荧光测定法,涉及适合于实施所述方法的荧光测定计,并且涉及用于化合物的荧光测定法的托盘。
背景技术:
:在血液循环中存在有游离核酸是数年前就已知的[Mandel和Metais,1947;Tan等人,1966]。从这时开始,已经使用例如RIA(放射性免疫测定法)的方法发现,相对于患有良性肿瘤的患者或相对于健康受试者,癌症患者具有高水平的循环DM[Leon等人,1W7;Shapiro等人,1983]。然而,近些年来,随着高效的分子生物学方法例如实时PCR的开发,考虑将循环的DN***断用作临床生物标志物的兴趣得到迅速发展。从癌症患者的血浆中提取的DNA通常具有肿瘤DNA特征[,1999]例如链不稳定性、存在有特定的致癌基因、肿瘤抑制基因和小随体改变。这个来源于肺瘤细胞的循环DNA的想法是由Kok等人设想的[DeKok等人,1997],其报道了特征在于特定改变的从肿瘤衍生的DNA可以在患有结肠直肠肿瘤的患者的血清中。因此,这些作者检测了以前已经在原发肿瘤中鉴定的血清的DNA中的某些K-ras点突变。这就是循环DNA的大多数研究集中在从各类癌症患者的肿瘤
(组织)或血清提取的DM的突变的检测、杂合性的丧失、小随体突变和***化作用的原因。在血清的游离基因组DNA中检测到的小随体突变和不稳定性提示,其可能是新的潜在标记物,对于监控肿瘤具有重要的特异性。最近,许多研究试图使用基因组DNA、非基因组DM、循环DNA浓度的仅有的增加作为诊断标记物或乳腺癌和肺癌的早期形成的标记物,以及用于监控和检查已经接收化学疗法治疗的患者[Sozzi等人,2001]。这种测量会消除或至少减少对更侵入性操作例如活体检查的需要。它还可以用于筛选特定的早期癌症,例如肺癌[Sozzi等人,2003]、乳腺癌[Gal等人,2004]或前列腺癌[Boddy等人,2005;Jung等人,2004]。最后,它还可以用于补充通常用于监控患有癌症或经历化学疗法的患者或经历外科手术、创伤[Lam等人,2003]或心肌梗塞[Chang等人,2003]的患者的标记物的分析。在血液中主要循环两种DNA:-与循环的有核细胞有关的DNA;和-在血浆中游离循环的DNA。在患有癌症或患有心肌梗塞的患者中,血清中的基因组DNA是片断的,在恶性肿瘤的情况中有大约lOO个碱基对[Wu等人,200"的片段,而在心肌梗塞的情况中有大约200个碱基对[Chang等人,2003]的片段。这些片断在没有病变的对照者的血液中没有发现,在所述对照者中,发现循环的DNA为极低的浓度。即使现在,关于DNA被释放到血流中的机理仍知之甚少。Jahr等人[Jahr等人,
2001]提出了凋亡和坏死的细胞是这种DNA的主要来源的假设。目前没有参考文献限定在健康受试者中的这种循环的DNA浓度的限值。许多研究试图估计这个阈值,但是作为方法对它们进行比较是十分困难的,并且得到的结果有不同程度的差异。此外,在不同研究之间所用的单位有所不同ng/ml、拷贝数/ml、基因组当量/ml()、等等。许多研究组通过探索在预后中的应用前景、特别是试图确定与常规诊断标记物的相关性而测量了循环DNA的水平。到目前为止,所有的研究在以下方面是一致的,即癌症患者中的DNA平均水平比健康对照中显著更高,而与使用血清或是血浆无关。然而,测量的绝对数量在不同研究之间有所不同。这种差异可能是与所分析的癌症类型和所用的不同方法有关。如公布的大量数据所证实的,在血浆中测量的DNA水平低于血清中测量的水平[Thijssen等人,2002]。对于临床重要性,至少两个报告描述了DM水平和已知的预后因素之间的相关性。在(小细胞或非小细胞)肺癌中,在血浆DNA和血清的LDH活性和神经元特异性烯醇酶(NSE)之间具有紧密的相关性,在每种标记物和患者存活之间具有相似的关系[Fournie等人,1995]。类似地,DNA水平已经与在淋巴结转移性病灶的情况中的临床阶段以及乳腺癌患者的肿瘤大小相关[Shao等人,2001]。最后,重要的是要记住,由于肿瘤的原因,循环DM的百分率
在不同患者之间显著不同[Jahr等人,2001]。现在有许多用于测量溶液中核酸的方法,并且取决于方法允许根据临床医师和研究人员的不同需要进行改进。这些方法主要包括分光光度测定法[Greenstock等人,1975]—是在所有研究实验室中非常常用的方法,优点在于廉价,但是在临床实践中的主要缺点是极其不灵敏其不能测量患者中的循环DNA的量。有其它更灵敏的方法,但是它们都具有使得它们或多或少难以常规使用的特征,部分是因为它们具有在测量之前从生物环境提取DNA的共同的步骤放射免疫测定方法[Leon等人,1975]花费相对长的时间(每个分析系列要几个小时),必需以一系列测量来进行而不能分散地进行,尤其是,需要被批准处理放射性元素的专门建筑物和工作人员。.竟争性PCR[Siebert等人,1992;Yap等人,1992]基于相对于已知标准样品的相对显示,是提供检测灵敏度和特异性的多种系列方法的补充。这些方法是使用不便的并且相对机密的;其在医用分析实验室中的常规使用在将来是不可想象的。.实时的定量PCR[Mulder等人,1994]是涉及测量循环DNA这个问题的各种出版物中的优选方法。其优点是双重的其对于要显示的目标DNA(在这种情况中为人DNA)是特异性的,并且其现在不再是研究实验室的禁区,可以在许多医院找到设备。然而,它也不是没有缺点必需进行提取、相对高的操作成本、特定的设备不能用于大规模常规分析、以及灵敏性不足。
■定量的荧光测定法[Greenstock等人,1975]。尽管这种方法没有免除提取步骤,但是其允许更快速地和直接地测量存在于溶液中的游离DNA。然而,使用所述方法所需的技术条件(微量培养板、大量的试剂、测量荧光)使其难以达到期望的灵敏度极限并且不允许识别所检测的DNA的来源(人或非人来源)。因此,本发明设法提供没有现有技术方法的缺点的用于测定在样品中存在的核酸的量的方法。因此,本发明的出发点在于本发明人证明了有可能通过向样品加入荧光团和通过在同步分析中、或在响应于至少两个、特别是至少三个相应波长的激发而产生的至少两个、特别是至少三个不同的发射波长测定发射的焚光强度来测定在样品中存在的核酸的量。
发明内容本发明涉及在至少两个、优选至少三个波长测定在样品中存在的核酸的量的方法,其中-向样品添加荧光团,-分别测量响应于至少两个、优选三个激发波长的光刺激而由至少两个、优选至少三个发射波长发射的荧光强度,和从至少两个、优选至少三个测量的荧光强度推导存在于样品中的核酸的量。在前述方法的特定实施方案中,分别测量响应于三个激发波长入VA,2和A,3的光刺激而由荧光团在三个发射波长、、入2和入3发射的荧光强度I"12和13,其中入!〈入2〈入3和M,入2和入3是预先确定的。在前述方法的另一个特定的实施方案中,从以下F值推导核酸的y3-;i
义,一义,在前述方法的另一个特定的实施方案中,荧光团是Picogreer^,波长如下入,,=472±10(优选±5)nm入,=502±10(优选±5)nm入,2=496±10(优选±5)nm入2=526±10(优选±5)nm入,3-538±10(优选±5)nm入3=568士10(优选±5)nm此外,在前述方法的另一个特定的实施方案中,分别测量响应于两个激发波长入,i和A,2的光刺激而由荧光团在两个发射波长、和入2发射的荧光强度L和12,、和入2是预先确定的。在这里,优选从I!和12之差的绝对值推导核酸的量,即,从以下的F值仍在这种情况中,如果荧光团是Picogreei^,则波长如下入,严472土10nm入严502土10nm,和更具体地说,使用校准曲线从F值推导样品中的核酸的量。本发明还涉及适合于实现上述定义的方法的焚光测定计,特征在于,其包括-一个或多个用于在两个和/或三个激发波长入、入,2和任选的入,3进行光激发的设备;-一个或多个用于测量在三个发射波长入^入2和任选的入3发射的荧光强度L、12和任选的13的设备;-允许计算以下F值的计算装置入,2=496土10nm入,产496土10nm入2=526±10nm,或入严526±10nm,和538±10nm入2=568±10nm/1,/3-v义i—义?说明书第6/32页在前述荧光测定计的特定实施方案中,对于三个波长,所述激发和发射波长如下入,产472±10(优选±5)nm入!=502士10(优选±5)nm入,2=496±10(优选±5)nm入2-526±10(优选
±5)nm入,3=538±10(优选±5)nm入3-568±10(优选±5)nm在前述荧光测定计的另一个特定实施方案中,对于二个波长,所述激发和发射波长如下入,产472+10nm入产502土10rnn,和入,2=496+10mn入2=526±10mn,或入,产496士10nm入严526土10nm,和入,2-538±10nm入2=568±10nm本发明还涉及设计用于化合物的焚光测定的托盘,其包括混合和测量器皿,所述混合和测量器皿至少对于用于荧光分析的波长的光是透明的,所述器皿连接于包含荧光团的储库,所述荧光团储库本身连接于包含稀释溶液的储库;并且连接于-用于使包含待分析化合物的样品体积标准化的储库,所述标准化储库本身连接于用于收集包含待分析化合物的样品的孔。在上述定义的托盘的特定实施方案中,存在有单向阀,所述单向阀的位置为-在收集孔和标准化储库之间,使得收集的溶液只能够沿标准化储库的方向通过;-在标准化储库和混合和测量器皿之间,使得收集的溶液只能够朝向器皿的方向通过;-在包含稀释溶液的储库和荧光团储库之间,使得稀释溶液只能够朝向荧光团储库的方向通过;-在荧光团储库和混合和测量器皿之间,,由标准化储库、混合物和测量器皿、荧光团储库和稀释溶液储库组成各个隔室是由充分挠性的材料制成的,以便允许通过对容器施加压力而使器亚中包含的液体移动。在上述定义的托盘的另一个特定实施方案中,所述该荧光团为
Picogreen,而稀释溶液是Tris-Botrate-EDTA(TBE)緩冲液。在上述定义的托盘的另一个特定实施方案中,标准化储库与用于选择收集溶液所含的、长度小于1,000个核苷酸的核酸分子的设备耦联。发明详述核酸核酸可以是天然或合成来源的,并且其结合的核苷酸,特别是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸,可以是天然的或经过修饰的。优选地,核酸是DNA或RNA,更优选为DNA。另外优选地,核酸链的大小为大于五个碱基。有利地,样品中具有低分子量链(例如,长度小于1,000个碱基)的核酸的特异性量化(任选地在使用适合的方法选择这些核酸之后)允许量化例如得到所述样品的生物或培养物中由于细胞的凋亡所引起的死亡;可以将如此测量的值与任选地在不使用用于选择小于l,OOO个碱基对大小的链的任何方法的情况下测量的DNA总量的值相关,以便提供凋亡引起的细胞死亡的百分比。还可以通过测量总的核酸和通过在使用适合的方法除去低分子量核酸之后测量高分子量的核酸来量化凋亡。然后可以通过减去高分子量核酸得到低分子量核酸的量。任选地,可以通过低分子量核酸的特异性选择来直接进行量化。然后也可以特异性地测量剩余的高分子量核酸。因此,通过将二者的量相加得到总的核酸。为了量化凋亡,可以在DNA与荧光团的相互作用之后通过荧光进行低分子量核酸或高分子量核酸以及总的核酸的特异性量化。所述核酸可以预先使用任何适合的方法进行捕获和
/或浓集。本发明框架内的凋亡量化可以随着实验的进行而在动态条件下进行。实际上,不需要例如停止细胞培养来进行测量,因为测量的是在外部介质(即,培养基)中除去的核酸片断。其余的活细胞允许继续进行实验。因此,有可能根据需要在短时间之后、或者在其后的任何时候进行重复测量。同样地,有可能测量在人或动物中发生的凋亡,测量介质是本文中的任何类型的生物样品。因此,有可能想到许多的应用领域例如医疗领域、对动物或细胞培养物进行的实验规程等等。可以在任何类型的液体中测量核酸片断,无论是天然的或非天然的。一个领域特别地涉及对动物或对细胞培养物进行的药理学研究。特別是包括-试验药物的致死率;-确定细胞死亡诱导模式,例如坏死或凋亡;确定在所用的实验条件下发生第一个细胞死亡而其它细胞保持生存的时间,允许实验继续进行。另一个领域涉及对细胞培养物进行的科学研究。实际上,有可能研究以下情况对细胞死亡的影响代谢途径的刺激或钝化,或所用的实验条件。然而,另一个领域涉及对动物进行的实验规程,用于试验以下情况的影响-药物对随才几细胞死亡的影响-诱导的细胞死亡,或-实验条件。除了上述那些之外,感兴趣的是在对患有诱导细胞死亡的病理学的患者进行的监控或跟踪中量化凋亡,用以诊断它们的病理学或跟踪它们的治疗效果。一般地说,应用领域为其中需要知道以下内容的情况细胞死亡是否发生、死亡诱导模式、发生之前的延迟、以及所研究的作用的持续时间。因此,优选将已经通过上述定义的方法测定的核酸
的量用于细胞死亡表征的情况中。样品样品可以是天然的或合成的来源,为无机的或有机的。优选地,样品是生物样品或生物样品衍生物。更优选地,样品来自于生物样品的稀释。生物样品可以来自动物(特别是人)或来自植物。还优选地,生物样品选自以下的组细胞培养物、全血、血清、血浆、血液的有形成分、红细胞、尿、粪便、脑脊液、精液、穿刺液、痰液(expectora)、唾液、支气管和肺泡液体、脓、生殖道分泌物、羊水、胃液、胆汁、胰液、组织活体检查、毛发、皮肤和牙齿、以及淋巴液。还优选地,样品来源于经历过其中已经发生细胞破裂的生理病理学情况的患者。特别地,样品来源于以下患者患有或者被怀疑患有癌症的患者、正在经历化疗的患者、经历过外科手术的患者、创伤患者和经历过心肌梗塞的患者。优选地,包含在生物样品中的核酸来源于生理学或病理学来源的细胞胞溶作用,特别地,核酸来源于凋亡的细胞。样品特别优选是稀释20到400倍的血浆。有利地,本发明的方法允许量化任何期望样品内的核酸,无需事先进行核酸的纯化。荧光团术语"荧光团"是指容易响应于光激发而发光的化合物。在本发明中,优选荧光团易于通过与核酸建立弱或强的相互作用或化学键而与其发生相互作用。通常,可以将与