修饰的因子Ⅶ多肽及其应用的制作方法 1.docx

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专利名称:修饰的因子Ⅶ多肽及其应用的制作方法
技术领域:
本发明提供了修饰的治疗性蛋白质。本发明特别提供了修饰的因子VII多肽及其应用,所述多肽包括因子VIIa及其它形式的因子VII。
背景技术:
止血是使出血停止的复杂生理过程。血小板、血浆蛋白、和血管及内皮细胞是这个过程的三个成分,每个成分在紧随组织损伤后的事件中均起重要作用,并且在正常情况下使血凝块快速形成。关键的是凝血级联反应,这是一系列蛋白酶解事件,其中某些血浆蛋白(或者凝血因子)在“级联”中相继被另一先被活化的凝血因子激活,导致凝血酶的迅速形成。随后在这个级联中产生的大量凝血酶使纤维蛋白原裂解为血凝块形成所需的纤维蛋白肽。凝血因子作为无活性的单链酶原循环,在一或多个部位通过裂解被活化而产生双链活性形式的蛋白质。因子VII(FVII)是维生素K依赖性血浆蛋白,最初在血液中以酶原循环。FVII酶原在单一位置Arg152-Ileira被蛋白酶解活化,产生由单一二硫键连接的双链蛋白酶(FVIIa)。FVIIa结合其辅因子组织因子(TF)形成复合物,其中FVIIa可有效地使因子X(FX)活化为FXa,从而起始导致纤维蛋白形成和止血的一系列事件。虽然在大多数情况中实现正常止血,但是该过程中的缺陷可以导致出血性疾病,其中血凝块形成的时间延长。这种疾病可以是先天或者后天的。例如,血友病
A和B是遗传性疾病,特征分别在于因子VIII(FVIII)和因子IX(FIX)的缺陷。替代治疗是血友病A和B的传统治疗方法,包括静脉内施用从人血浆制备或者作为重组蛋白质的FVIII或者FIX。然而在许多情况中,患者产生针对输注蛋白质的抗体(也称作抑制剂),其降低治疗效力或者使治疗无效。已经许可重组FVIIa(N0V0Seven(凝血因子VIIa(重组))用于治疗具有FVIII或FIX抑制剂的血友病A或者B患者,且还用于终止与创伤和/或手术相关的出血事件或者防止出血。重组FVIIa也被许可用于治疗先天性FVII缺陷的患者,并越来越多地用于标示外使用(off-labeluse),如治疗与非血友病患者中先天性或者获得性出血疾病、创伤和手术相关的出血。重组FVIIa促进血凝块形成的应用突出了其作为治疗剂的越来越重要的特点。FVIIa治疗明显未满足临床需要。例如,基于临床试验数据,需要在6小时或更多的时间平均3剂FVIIa以处理血友病患者的急性出血事件。需要更有效的FVIIa变体以减少这些需求。因此,本发明的一个目的是提供修饰的FVII多肽,其被设计为具有改良的治疗性质。概述本发明提供了修饰的因子VII(FVII)多肽。本发明特别提供了呈现促凝血剂活性的修饰的FVII多肽。该FVII多肽与未修饰的
FVII多肽相比在一级序列中被修饰,且可包括氨基酸插入、缺失和置换。本发明提供的修饰的FVII多肽包括这样的FVII多肽,其呈现出对于抑制剂如抗凝血酶-III(AT-III)和组织因子途径抑制剂(TFPI)的抗性增加、对于Si2+抑制作用的抗性增加、在有和/或无TF的条件下催化活性增加,具有改良的药动学性质如增加的半衰期、与血小板表面的结合和/或亲和性增加、与血清白蛋白的结合和/或亲和性增加,以及与血小板整联蛋白αIIbβ3的结合和/或亲和性增加。所述修饰的FVII多肽可含有本文提供的修饰的任何组合,由此与未修饰的FVII多肽相比上述多肽的一或多种活性或者性质被改变。典型地,修饰的FVII多肽保留促凝血剂活性。本发明还提供了编码/表达修饰的FVII多肽的核酸分子、载体和细胞。本发明还提供了药物组合物、制品、试剂盒和治疗方法。FVII多肽包括等位基因变体和物种变体以及具有影响其它活性和/或性质的修饰的多肽和其它变体。本发明还包括包含本发明提供的修饰的FVII多肽的活性片段。举例FVII多肽是包含SEQIDNO3所示氨基酸序列的那些多肽以及与其具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的变体。本发明提供的修饰的因子VII(FVII)多肽,其在FVII多肽中在具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的FVII多肽的Q286位置或者在FVII多肽的对应残基上具有修饰。所
述修饰可以是氨基酸置换、氨基酸插入或者缺失或其组合。在修饰是氨基酸置换的情况中,所述置换可以是由碱性氨基酸(例如Arg(R)、Lys(K)和His(H))或者选自如下的氨基酸置换=Arg(R)、Lys(K)His(H)、Tyr(Y)、Gly(G)、Phe(F)、Met(M)、IIe(I)、Leu(L)、Val(V)、Pro(P)、Glu(E)、Trp(W)、Asp(D)和Cys(C)。举例的这种氨基酸置换包括Q286R,Q286K,Q286H、Q286Y、Q286G、Q286F、Q286M、Q286I、Q286L、Q286V、Q286P、Q286E、Q286W、Q286D以及Q286C。这种修饰可以在含有SEQIDNO:1_3任一所示序列的未修饰的FVII多肽、或者其等位基因变体或者物种变体、或者与SEQIDNO1-3任一所示FVII具有至少60%序列相同性的变体、或者包含SEQIDNO:1-3任一所示氨基酸序列的FVII多肽的活性片段或者其等位基因变体或者物种变体、或者与SEQIDNO1-3任一所示FVII具有至少60%序列相同性的变体中产生。例如,修饰的FVII多肽可以是在对应FVII多肽中Q286位置的位置含有置换的活性片段。在一些实例中,本发明提供的修饰的FVII多肽在对应具有SEQIDNO:3所示氨基酸序列的FVII多肽的位置286或者FVII多肽中对应残基的位置含有氨基酸置换,其中所述修饰是在位置286的由碱性氨基酸置换,导致修饰的FVII多肽与在位置286不具有修饰的FVII多肽相比呈现出增加的凝血剂活性。所述碱性氨基酸可选自
Arg(R)、Lys(K)和His(H)。例如,本发明提供的修饰的FVII多肽在位置286可含有Gln(Q)由Arg(R)的置换。在一些实例中,所述修饰的FVII多肽仅具有在位置观6的单一修饰。在其它实例中,所述修饰的FVII多肽在FVII多肽的另一位置还含有一或多个其他修饰。所述其他修饰可以是氨基酸置换、插入或者缺失。例如,所述其他修饰可以是在对应选自如下位置的位置的氨基酸置换A51、S52、P54、S60、Q66、Y68、K109、S119、A122、G124、T130、E132、V158、K161、A175、D196、K197、K199、R202、H216、S222、G237、T239、H257、Q286、L287、R290A292、A294、E296、M298、L305、S314、G318、P321、K337、K341、Q366、H373、F374、E394、P395和R396。举例的这种修饰包括D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、R290M、R290V、K341E、K341R、K341Q、K341N、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS,G237T238insV,G237T238insAS,G237T238insSA,D196K197insK,D196K197insR,D196K197insY,D196K197insff,D196K197insA,D196K197insM,K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA、K197I198insS、T239S、T239N、T239Q、T239V、T239L
、T239H、T239I、L287T、M298Q、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366E、Q366N、Q366T、Q366S、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373L、H373I、H373F、H373A、K161S、K161A、K161V、H216S、H216A、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222N、S222E、S222D、H257A、H257S、GlaSwapFIX、{GlaSwapFIX/E40L}、{GlaSwapFIX/K43I}、{GlaSwapFIX/Q44S}、{GlaSwapFIX/M19K}、{GlaSwapFIX/Ml9K/E40L/K43I/Q44S}、GlaSwapFX、GlaSwapProtC、GlaSwapProtS、GlaSwapThrombin、S52A、S60A、E394N、P395A、R396S、R202S、A292N、A294S、G318N、A175S、K109N、A122N、G124S、A51N、T130N、E132S、S52N、P54S、S119N、L121S、T128N、P129A、Q66N、Y68S、S103SllldeliηsQRLMEDICLPRffGCLffEDDF,H115S126de1iηsQRLMEDICLPRffGCLffEDDF,T128P134delinsQRLMEDICLPRffGCLffEDDF,S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE,H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE,T128P134delinsIEDICLPRffGCLffE,S103S111de1iηsDICLPRffGCLffED,H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、P406insGGGSIEDICLPRWGCLW,P406insDICLPRWGCLWED,P406insGGGSDICLPRWGCLWED,S103S1IldelinsSFGRGDIRNV,Hl15S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、P406insCSFGRGDIRNVC
、P406iηsGGGSCSFGRGDIRNVC,V158T、V158D、L287T、E296V、M298K和M298Q0举例的本发明提供的修饰的FVII多肽是含有如下修饰的那些Q286R/M298Q、Q286R/GlaSwapFIX、Q286R/H257A、Q286R/S222A、Q286R/S222A/H257A、Q286R/S222A/GlaSwapFIX、Q286R/H257A/GlaSwapFIX、Q286R/S222A/H257A/GlaSwapFIX、Q286R/M298Q/K341Q、Q286R/M298Q/K199E、Q286R/M298Q/GlaSwapFIX、Q286R/Q366V、Q286R/A292N/A294S/Q366V、A175S/Q286R/Q366V、S222A/Q286R/Q366V、H257S/Q286R、H257S/Q286R/Q366V、S222A/H257A/Q286R/Q366V、Q286R/H373A、S222A/H257A/Q286R/M158Q、Q286R/K341D、Q286R/Q366D、Q286R/Q366N、Q286R/M298Q/Q366D、Q286R/M298Q/Q366N、Q286R/H373F、Q286R/M298Q/H373F、{GlaSwapFIX/E40L}/Q286R/M298Q,{GlaSwapFIX/K43I}/Q286R/M298Q,{GlaSwapFIX/Q44S}/Q286R/M298Q、{GlaSwapFIX/M19K}/Q286R/M298Q、{GlaSwapFIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M298Q,T128N/P129A/Q286R,T128N/P129A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/H373F、V158D/Q286R/E296V/M298Q、GlaSwapFIX/T128N/P129A/S222A/Q286R,GlaSwapFIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q,T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q,T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F,S52A/S60A/Q286R
、GlaSwapFIX/S52A/S60A/S222A/Q286R、S52A/S60A/Q286R/M298Q、GlaSwapFIX/S52A/S60A/Q286R/M298Q、S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q、S52A/S60A/Q286R/H373F/,S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F、T239V/Q286R、GlaSwapFIX/S222A/T239V/Q286R、T239V/Q286R/M298Q、S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q、GlaSwapFIX/T239V/Q286R/M298Q、T239V/Q286R/H373F、T239V/Q286R/M298Q/H373F、T239I/Q286R、GlaSwapFIX/S222A/T239I/Q286R、T239I/Q286R/M298Q、S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q、GlaSwapFIX/T239I/Q286R/M298Q、T239I/Q286R/H373F、T239I/Q286R/M298Q/H373F、GlaSwapFIX/S222A/Q286R/H373F、GlaSwapFIX/S222A/Q286R/M298Q、GlaSwapFIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F、V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F、H257A/Q286R/M298Q、H257S/Q286R/M298Q、GlaSwapFIX/S222A/H257S/Q286R/、S222A/H257S/Q286R/M298Q、H257S/Q286R/M298Q/H373F、S222A/Q286R/M298Q/H373F、S222A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/Q286R、A122N/G124S/A175S/Q286R、
GlaSwapFIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R、GlaSwapFIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q286R、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q、A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q、A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F、A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F、{GlaSwapFIX/K43I}/TU8N/PU9A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N、{GlaSwapFIX/K43I}/Q286R/M298Q/Q366N、{GlaSwapFIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N,V158D/Q286R/E296V/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F、T239V/Q286R/M298Q/Q366N、T239I/Q286R/M298Q/Q366N、T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q、T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q,T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F,T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q或者T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F。本发明提供了在FVII多肽中含有两或更多个修饰的修饰的FVII多肽、其等位基因变体或者种变体或者其活性片段。这种多肽的至少一个修饰是在对应具有