使用重组微生物制备(s)-3-羟丁酸和(s)-3-羟丁酸酯的方法.docx

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专利名称::使用重组微生物制备(s)-3-羟丁酸和(s)-3-羟丁酸酯的方法
技术领域:
:本发明涉及一种使用重组微生物制备光学活性(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯的方法。更具体地说,本发明涉及一种用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物,用编码β-***硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因和编码酰基辅酶A水解酶的基因转化该微生物;一种使用所述重组微生物制备(S)-3-羟丁酸的方法;一种用于制备(S)-3-羟丁酸酯的重组微生物,用编码***硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码酰基辅酶A水解酶的基因和编码脂肪酶的基因转化该微生物;以及一种使用所述重组微生物制备(S)-3-羟丁酸酯的方法。
背景技术:
:(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯是十分有效的手性中间体,并具有广泛的应用,如在塑料、芳烃、医药和农药领域中(SpecialityChemicalsMagazine,April:39,2004)。例如,它们可以用来合成(S)-1,3-丁二醇、用于通过还原乙基_(S)-3-羟丁酸酯制备多种抗生素和信息素的中间体(,Tetrahedron,46:6311,1990),并且还可用作除草剂(S)-
食菌甲诱醇((S)-sulcatol)的前体(,Tetrahedron,371341,1981)、b_内酰***类抗生素碳青霉烯(Carbapeneme)的前体(,Chemistryletters,162187,1987),以及维生素样营养物L-肉毒碱的前体(,JournalofAmericanChemicalSociety,105:5925,1983)。有制备酯的传统方法,如用催化剂二膦化钌对前手性前体3-***酸酯的非对称还原S化作用(,JournaloftheAmericanChemicalSociety,109:5856,1987),但这种方法需要非常昂贵的金属催化剂、纯底物和非常高的压力反应器。此外,使用酵母作为全细胞催化剂通过生物催化还原b-***酸酯生产的(S)-3-羟丁酸乙酯(产率58%且光学纯度为94%ee)由于在微生物中存在的各种氧化还原酶而表现出低光学活性(TetrahedronLetters,34:3949,1993)。据报道,光学活性(R)-3_羟基烷酸酯是通过操纵微生物的代谢途径由葡萄糖生物合成的(Lee等,BiotechnolBioeng,65:363,1999;Lee禾口Lee.,ApplEnvronMicrobiol,691295,2003;Gao等,FEMSMicrobiolLett,213:59,2002)。有两条路线生产(R)_3_羟基烷酸酯一是可生物降解的聚合物(多羟基烷酸酯)的自溶(Lee等,BiotechnolBioeng,65:363,1999;Lee和Lee.,ApplEnvironMicrobial,691295,2003);另一种是从由葡萄糖合成的
(R)_3-羟基烷酰辅酶A中移除辅酶A,而不是可生物降解聚合物的自溶,以制备(R)-3-羟基烷酸酯(Gao等,FEMSMicrobiolLett,213:59,2002)。在第二路线中,(R)-3-羟丁酰辅酶A是使用β-***硫解酶(PhaA)和(R)-3-羟丁酰辅酶A还原酶(PhaB)由葡萄糖制备,然后使用磷酸转丁酰酶(Ptb)和丁酸激酶(BuK)从(R)-3-羟丁酰辅酶A中移除辅酶A(Gao等,FEMSMicrobiolLett,213:59,2002)。虽然已报道了用于制备光学活性(S)-3_羟丁酸酯的化学和生物催化路线,但是通过操纵微生物的代谢途径由葡萄糖生物合成制备光学活性(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯的路线还未见报道。因此,本发明者试图生物合成光学活性(S)-3_羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯,并最终发现,通过简单的过程由在微生物的糖酵解中产生的乙酰辅酶A生物合成具有高光学纯度的(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯,该过程包括通过引入到微生物中的重组基因操纵代谢途径而不用使用昂贵的金属催化剂或底物。他们的这一发现导致本发明。
发明内容技术问题本发明旨在提供用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物和包括培养所述重组微生物的制备(S)-3-羟丁酸的方法。本发明进一步旨在提供用于制备(S)-3-羟丁酸酯的重组微生物和包括培养所述重组微生物的制备(S)-3-羟丁酸酯的方法。技术方案一方面,本发明提供了用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物,用编码***硫解酶的基因、编码
(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因和编码酰基辅酶A水解酶的基因转化该微生物。另一方面,本发明提供了用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物,用编码***硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码磷酸转丁酰酶(ptb)的基因和编码丁酸激酶(Buk)的基因转化该微生物。还一方面,本发明提供了制备(S)-3-羟丁酸的方法,其特征在于培养所述重组微生物。又一方面,本发明提供了制备(S)-3-羟丁酸的方法,其特征在于使所述重组微生物的培养物或细胞提取物与选自乙酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A和(S)-3-羟丁酰辅酶A中的底物反应。再一方面,本发明提供了用于制备(S)-3-羟丁酸酯的重组微生物,用编码β-***硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码酰基辅酶A水解酶的基因和编码脂肪酶的基因转化该微生物。还一方面,本发明提供了制备(S)-3-羟丁酸酯的方法,其特征在于培养所述重组微生物。有益效果本发明提供了通过简单的过程由在微生物的糖酵解中产生的乙酰辅酶A生物合成具有高光学纯度的(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯的方法,该过程包括通过引入到微生物中的重组基因操纵代谢途径而不用使用昂贵的金属催化剂或底物。图1显示了(S)-3_HB的生物合成途径。图2显示了(S)-3-HB的生物合成途径。图3显示了(S)-3-HB酯的合成途径。图4显示了pTacReA-HBD系列载体的酶切图谱。图5显示了pET21aBCH系列载体的酶切图谱。图6
显示了pK28BCH、pET28bBCH系列载体的酶切图谱。图7显示了pET21aHBD和pK21HBD系列载体的酶切图谱。图8显示了通过根据本发明制备的(S)-3-HB的***化作用得到的GC-MSD分析结formulaseeoriginaldocumentpage5图9显示了通过根据本发明制备的(S)-3_HB的***化作用的手性分析结果。图10显示了当(S)-3_HB通过根据本发明的补料分批培养制备时的时间图表。具体实施例方式如式1所示,由本发明的方法制备的(S)-3-羟丁酸是与(R)-3-羟丁酸具有不同手性的光学活性化合物。[式1]formulaseeoriginaldocumentpage5(R)-3-羟丁酸(S)-3-羟丁酸为制备(S)-3_羟丁酸,提供了用编码β-***硫解酶的基因、编码(S)-3_羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因和编码酰基辅酶A水解酶的基因转化的重组微生物。根据本发明,用编码***硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因和编码酰基辅酶A水解酶的基因转化的重组微生物通过图1所示的生物合成途径制备(S)-3-羟丁酸。首先,乙酰辅酶A是通过糖酵解由葡萄糖生产的,并通过β-***硫解酶转化成乙酰乙酰辅酶Α,然后乙酰乙酰辅酶A通过(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶转化成(S)-3-羟丁酰辅酶Α,且最后(S)-3-羟丁酰辅酶A通过酰基辅酶A水解酶转化成(S)-3-羟丁酸。本发明也提供了用于制备(S)-3_羟丁酸的用编码***硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码磷酸转丁酰酶
(ptb)的基因和编码丁酸激酶(Buk)的基因转化的重组微生物。根据本发明,用于制备(S)-3_羟丁酸的用编码β-***硫解酶的基因、编码(S)-3_羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码磷酸转丁酰酶(ptb)的基因和编码丁酸激酶(Buk)的基因转化的重组微生物通过图2所示的途径制备(S)-3-羟丁酸。当乙酰辅酶A通过糖酵解由葡萄糖产生时,乙酰辅酶A通过β-***硫解酶转化成乙酰乙酰辅酶Α,然后乙酰乙酰辅酶A通过(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶转化成(S)-3-羟丁酰辅酶A,(S)-3-羟丁酰辅酶A通过磷酸转丁酰酶(Ptb)或磷酸转乙酰酶(Pta)转化成(S)-3-羟丁酰磷酸酯((S)-3-hydr0Xybutyrylph0Sphate),且最终(S)_3_羟丁酰磷酸酯通过丁酸激酶(Buk)或丙酸激酶(Puk)转化成(S)-3-羟丁酸(见图2)。在本发明的一个实施方式中,用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物可用含有至少一种选自编码β-***硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因和编码酰基辅酶A水解酶的基因中的至少一种重组载体转化。例如,用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物可用含有编码β_***硫解酶的基因的重组载体、含有编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因的重组载体和含有编码酰基辅酶A水解酶的基因的重组载体转化。或者,用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物可用含有编码β-***硫解酶和(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因的重组载体和含有编码酰基辅酶A水解酶的基因的重组载体转化。在本发明的一个实施方式中,编码
β-***硫解酶的基因、编码(S)-3_羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因和编码酰基辅酶A水解酶的基因可被插入到用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物的染色体中。本发明还提供了用于制备(S)-3-羟丁酸酯的重组微生物,用编码β_***硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码酰基辅酶A水解酶的基因和编码脂肪酶的基因转化该微生物。如图3所示,根据本发明的用编码β-***硫解酶的基因、编码(S)-3_羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码酰基辅酶A水解酶的基因和编码脂肪酶的基因转化的重组微生物用脂肪酶通过(S)-3-羟丁酸的酯化作用制备(S)-3-羟丁酸酯,该(S)-3-羟丁酸是通过图1所示的(S)-3-羟丁酸的生物合成途径制备的。在本发明中,可以无限制使用编码上述酶(包括β-***硫解酶、(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、酰基辅酶A水解酶和脂肪酶)的任何一个基因。虽然在下面的实施例中使用具体的基因,本领域的技术人员将清楚地理解到,本发明的范围并不限于在此公开的具体基因。在本发明的一个实施方式中,编码β-***硫解酶的基因可由SEQIDNo1表示。在本发明的一个实施方式中,编码(S)-3_羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因可由SEQIDNo:2或3表示。在本发明的一个实施方式中,酰基辅酶A水解酶可以是(S)-3-羟丁酰辅酶A水解酶。在本发明的一个实施方式中,(S)-3-羟丁酰辅酶A水解酶可由SEQIDNo4的碱基序列编码。在本发明中,载体指的是含有
DNA序列的DNA结构,该DNA序列可操作地连接至适合在合适的宿主中表达DNA的表达控制序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或只是潜在的基因组插入片段。当用载体转化合适的宿主时,载体可不顾宿主基因组而自我复制或运行,或在某些情况下可整合到宿主基因组中。质粒是载体最常见的类型,因此,术语“质粒”和“载体”在以下交替使用。然而,本发明还包括不同形式的载体,其在本领域中已知或者被认为实现与传统的载体相同的机能。“表达”控制序列是指在特定宿主细胞中表达可操作连接到其他DNA序列的编码序列所必需的DNA序列。此控制序列包括用于起始转录的启动子、用于控制转录的任意操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和用于控制转录和翻译的终止的序列。例如,针对原核生物的控制序列包括启动子、任意操纵基因序列和核糖体结合位点。对于真核生物,控制序列包括启动子、多腺苷酸化信号和增强子。在质粒中,启动子是对基因表达量影响最大的因素。对于高表达,可以使用SRa启动子或源于巨细胞病毒的启动子。为了表达本发明的DNA序列,各种表达控制序列的任何之一可以应用于载体中。例如,有用的表达控制序列包括SV40或腺病毒的早期和后期启动子、Iac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T3和T7启动子、λ噬菌体的主要操纵基因和启动子区域、fd编码蛋白质的控制区域、用于3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶启动子、用于磷酸酶
(如Pho5)的启动子、用于酵母α“交配系统的启动子、其他已知控制原核生物、真核生物或它们的病毒的基因表达的结构序列及它们的组合。当将核酸置入与另一核酸序列的功能关系中时,其被“可操作地连接”。核酸可以是被连接以在基因与控制序列(例如转录激活蛋白)结合时能够表达基因的基因和控制序列。例如,当前肽序列或分泌前导的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白时,其可操作地连接至编码多肽的DNA;当启动子或增强子影响序列的转录时,其可操作地连接至编码序列;以及当核糖体结合位点影响序列的转录时,其可操作地连接至编码序列,或者当设置核糖体结合位点促进翻译时,其可操作地连接至编码序列。一般来说,术语“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是毗邻的,而且在分泌前导的情况下,是毗邻的且在阅读框中存在。然而,增强子不必为毗邻的。这些序列之间的连接是通过在方便的限制性内切酶酶切位点的连接作用实现的。然而,当该酶切位点不存在时,按照传统方法使用合成的寡核苷酸接头或者连接体。在此使用的术语“表达载体”通常是指作为重组载体的双链DN***段,其中插入了异源DN***段。在此,异源DNA指不是在宿主细胞中天然产生的异型DNA。表达载体一旦在宿主细胞中,可不顾宿主染色体DNA而自我复制,并可产生几个拷贝的载体和插入它们中的(异源)DNA。在现有技术中众所周知的,为增加宿主细胞中转染基因的表达水平,相应的基因应可操作地
连接至在选择的表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列。优选地,表达调控序列和相应的基因连同细菌筛选标记和复制起点一起包括在一个表达载体中。当表达宿主是真核细胞时,表达载体还应包括在真核表达宿主中有用的表达标记。在本发明中,各种载体可用作重组载体,包括质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体和酵母人工染色体(YAC)载体。例如,质粒载体可包括(a)复制起点,用于有效复制以在一个宿主细胞中有几百个拷贝,(b)抗生素抗性基因,用于筛选用质粒载体转化了的宿主细胞,和(c)限制性内切酶酶切位点,使外源DN***段能够插入其中。即使没有合适的限制性内切酶酶切位点,根据常规方法使用合成的寡核苷酸接头或者连接体可以容易地连接载体与外源DNA。根据本发明的重组载体可以通过传统方法引入到适当的宿主细胞中。可以使用细菌、酵母或真菌细胞作为宿主细胞,但本发明并不限于此。本发明中的宿主细胞优选包括原核细胞,如大肠杆菌。优选的大肠杆菌菌株包括大肠杆菌菌株BL21、大肠杆菌菌株DH5a、大肠杆菌菌株JM101、大肠杆菌K12菌株294、大肠杆菌菌株W3110、大肠杆菌菌株X1776、大肠杆菌XL-IBlue(Stratagene)和大肠杆菌B。此外,可以使用其他大肠杆菌菌株(诸如FMBlOU匪522、匪538和匪539)以及其他原核细胞种属。除了大肠杆菌菌株之外,可以使用农杆菌属菌株