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使用可裂解探针检测c-Met基因的方法
一个具体的实施例的一种形式提供了用于检测c-Met基因表达的量的检测试剂盒,包含特异性地结合至c-Met基因的一对引物,以及可裂解探针,其特异性地结合至由该一对引物扩增的c-Met扩增产物之内。在另一个具体的实施例中,通过使用根据该一个具体的实施例的检测试剂盒测量样品中c-Met基因表达的量。当使用根据该具体的实施例的方法时,可以有效地检测甚至是处于低浓度下的c-Met基因表达的量,并且在癌症诊断和预后方面可以是有用的。
【专利说明】使用可裂解探针检测c-Met基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及癌症诊断试剂盒和使用其的诊断方法。更具体地,本发明涉及通过使用引物组和可裂解探针使得能够实时地检测基因的试剂盒以及使用其的诊断方法。
【背景技术】
[0002]c-Met是肝细胞生长因子(HGF)受体,而HGF是一种细胞因子,其结合至c-Met受体酪氨酸激酶的胞外区以引起各种正常细胞和肿瘤细胞中的分裂、移动、形态发生和血管生成。c-Met是存在于细胞表面的代表性的受体酪氨酸激酶。与HGF无关(其是配体),由于c-Met自身也是致癌基因并且有时参与多种相关的机制如肿瘤发生、转移、癌症细胞迁
移,癌症细胞侵袭和血管生成,因此c-Met是作为抗癌靶而引起关注的蛋白质。
[0003]此外,c-Met在许多类型的癌症中过表达。特别地,已知c-Met过表达主要涉及患者预后不良的原因。因此,可以使用可以特异性地扩增c-Met基因的引物组以通过使用取自患者的临床样品来测量患者中的癌症发展。此外,引物组可以被用作选择癌症治疗剂或治疗方法的重要决策信息。因此,需要开发特异性地结合至c-Met的基因或mRNA的引物或探针,或者能够验证c-Met基因或mRNA的过表达程度的诊断试剂盒。
[0004]最近,聚合酶链反应(PCR)被用于检测或扩增基因。利用PCR技术实现高通量PCR筛选已经引起了现代生物学和医学的创新性变革。分析技术对包括诊断、环境监测、血液检测和基因型分析在内的许多研究领域产生了重大影响。随着生物信息学时代的到来,科学家处理基因信息的能力超过以往任何时候。然而,为了能够检测较小量的DNA并实时验证DNA扩增量,许多相关研究仍在进行。
[0005]因此,改进PCR方法以开发检测c-Met基因的方法,其可以在癌症诊断中更加有效地使用。在以上结果的基础上,开发了本发明的基于探针的检测试剂盒和诊断方法。
【发明内容】
[0006]技术问题
[0007]本发明的一种实施方式提供了c-Met基因检测试剂盒,该检测试剂盒包含引物组和可裂解探针(cleavableprobe)。
[0008]本发明的另一种实施方式提供了通过使用含有引物组和可裂解探针的c-Met基因检测试剂盒检测c-Met基因的方法。
[0009]技术方案
[0010]根据本发明的一个方面,提供了用于检测c-Met基因的表达的检测试剂盒,其中,检测试剂盒包括:特异性结合至c-Met基因的引物组;特异性地结合至由引物组扩增的c-Met扩增产物的内部的可裂解探针。
[0011]本发明的一个实施方式提供了c-Met基因检测试剂盒,包括含有SEQIDNO:1的核酸的引物、含有SEQIDN0:2的核酸的引物和含有SEQIDN0:7的核酸的可裂解探针。
[0012]本发明的另一个实施方式提供了c-Met基因检测试剂盒,包括含有SEQIDN0:3的核酸的引物、含有SEQIDN0:4的核酸的引物和含有SEQIDN0:8的核酸的可裂解探针。
[0013]本发明的另一个实施例,提供了C-Met基因检测试剂盒,包括含有SEQIDN0:5的核酸的引物、含有SEQIDN0:6的核酸的引物和含有SEQIDN0:9的核酸的可裂解探针。
[0014]本文使用的术语"c-Met基因"是指编码结合到肝细胞生长因子(HGF)的受体酪氨酸激酶的基因。例如,c-Met基因可以对应于GenBank登录号NM_000245或GenBank登录号NM_000236。
[0015]c-Met蛋白在许多类型的癌症中过表达。特别地,已知c-Met过表达主要涉及患者中预后不良的原因。通过测定可能引起c-Met蛋白过表达的c-Met基因的过表达可以诊断的癌症类型包括肿瘤(恶性上皮肿瘤,carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤(blastoma)、肉瘤和白血病等,但不限于此。癌症(cancer)包括,例如,膀胱癌、乳癌(breastcancer)、子宫颈癌、胆管癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、胆囊癌、前列腺癌、甲状腺癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、纤维肉瘤、***T细胞白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤/星形细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤和肾母细胞瘤,但不限于此。
[0016]本文所用的术语"引物"可以与"寡核苷酸"或"多核苷酸"互换地使用。引物是指在PCR中用作DNA合成的起点的寡核苷酸。引物通常包含约15至约35个核苷酸,并与靶序列的互补区杂交。
[0017]本文使用的术语"探针"指的是特异性地结合至靶序列的寡核苷酸,并且包括,例如,含有特定区域的多核苷酸,该特定区域被设计为可通过序列特异方法与特定核酸序列(如靶核酸序列)互补区域杂交。在本发明的一个实施方式中,寡核苷酸探针包含约15至约60个核苷酸。适当地,寡核苷酸探针包含约18至约30个核苷酸。
[0018]本文使用的术语"可裂解探针(可断裂探针,cleavableprobe)"是指包括两种类型的核酸的探针,例如,在DNA探针的内部还包含一些RNA核苷酸的DNA探针。可裂解探针可以含有内部区域,其中约1至10个DNA核苷酸被替换为RNA核苷酸、其中约2至8个DNA核苷酸被替换为RNA核苷酸或者其中约3至7个DNA核苷酸被替换为RNA核苷酸,但并不限于此。此外,RNA核苷酸可以连续或不连续地定位于在探针内。适当地,可裂解探针可以是SEQIDN0S:7至SEQIDN0S:9的探针之一,但并不限于此。
[0019]此外,可裂解探针可以在探针的两端或内部标记有可检测物质。用于PCR的混合物包含RNA酶(核糖核酸酶,RNase酶),其可以特异性地切割RNA-DNA双链中的RNA序列部分。在由RNA酶切割后,可裂解探针的所有片段将在反应温度下从靶扩增子解离并散布在反应溶液中。由于标记在探针中的供体和受体被分离,可以监测供体的荧光发射。
[0020]本文使用的术语"标记物(标签,label)"或"可检测标记
"指的是通过共价键或非共价键结合至探针的荧光染料(荧光物,fluorochrome)化合物,并且可以是包含荧光供体和荧光受体的荧光共振能量转移(FRET)对。
[0021]本文使用的术语"荧光染料"是指被具有短于所发射的光的波长的波长的光激发后能发光的荧光物质。此外,术语"荧光供体"是指发射由本发明中公开的测定法测量的光的荧光染料。同时,荧光供体可以提供由荧光受体所吸收的光。本文使用的术语"荧光受体"是指吸收由荧光供体发射的能量的二级荧光染料或猝灭剂。二级荧光染料吸收由荧光供体发射的能量并且随后发射具有长于由荧光供体发射光的光的波长的波长的光。猝灭剂吸收从荧光供体发射的能量。
[0022]任何发光分子,适当地是荧光染料和/或猝灭剂,可以用于本发明的实施方式中。例如,发光分子可以是AlexaFluor350、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、7_二乙基氛基香?素_3_竣酸、突光素、OregonGreen488、OregonGreen514、四***若丹明、若丹明X、德克萨斯红(TexasRed)染料、QSY7、QSY33、Dabcyl、B0DIPYFL、B0DIPY630/650、B0DIPY6501665、B0DIPYTMR-X、BODIPYTR-X、二烷基氨基香豆素、
Cy3(青色素3)、、、Cy5、DTPA(Eu3+)-AMCA、#及TTHA(Eu3+)AMCA,但不限于此。适当地,发光分子可以是包括6-FAM和爱荷华黑BQ(IowaBlackBQ)的荧光共振能量转移对(FRET),但不限于此。
[0023]此外,用于检测c-Met基因的试剂盒可以进一步含有热稳定聚合酶或RNA酶,并且试剂盒中含有的酶可以是热稳定聚合酶及热稳定RNA酶。
[0024]在本文中使用并应用于酶的术语"热稳定的"是指酶在升高的温度下(例如55°C或更高),或在加热和冷却重复的循环中保持生物学活性。热稳定的多核苷酸聚合酶可以尤其适用于PCR扩增反应。在本发明的实施方式中,热稳定的多核苷酸聚合酶可以是Taq聚合酶。热稳定的多核苷酸聚合酶可以是选自由AmpliTaq、AmpliTaqStoffelfragment、SuperTaq、SuperTaqplus、LATaq、LAproTaq以及EXTaq组成的组中的Taq聚合酶。此夕卜,在本文中使用的术语"RNA酶"是指特异性切割RNA的酶。RNA可以是由使用RNA和DNA的杂交形成的杂交双链的双链RNA。
[0025]此外,试剂盒可以提供为包括具有一种或多种试剂的包装单元(packageunit)的试剂盒。试剂盒可以包含选自由以下物品组成的组中的至少一种:缓冲液、操作指南和阳性或阴性对照组。试剂盒可以包括以适当比例混合以进行本文所描述的方法的试剂的容器。试剂容器适当地包括单位数(
unitnumber)的试剂以省略完成该方法时的衡量(计量,measuring)。在本发明另一个实施方式中,试剂盒进一步包括用于从生物学样品提取基因组DNA或RNA的试剂。此外,试剂盒试剂可以包括用于逆转录酶-PCR分析的试剂。
[0026]本发明的另一个方面提供了检测c-Met基因的方法,该方法包括:
[0027]从样品中获得DNA;
[0028]使样品与选自由以下组成的组中的至少一个引物-探针组混合以制备混合物:包括含有SEQIDNO:1的核酸的引物、含有SEQIDN0:2的核酸的第二引物以及含有SEQIDNO:7的核酸的可裂解探针的第一引物-探针组;包括含有SEQIDNO:3的核酸的引物、含有SEQIDN0:4的核酸的引物以及含有SEQIDN0:8的核酸的可裂解探针的第二引物-探针组;包括含有SEQIDN0:5的核酸的引物、含有SEQIDN0:6的核酸的引物以及含有SEQIDN0:9的核酸的可裂解探针的第三引物-探针组;
[0029]使聚合酶、RNA酶和扩增缓冲液与该混合物混合以扩增混合物中的DNA;和
[0030]检测由探针上的标记发射的信号的增加。
[0031]检测c-Met基因的方法详细说明如下。
[0032]首先,检测c_Met基因的方法可以包括从样品获得DNA。样品可以获自癌症患者或愿意接受癌症进展诊断的个体,或特定的人体部分。
[0033]DNA可以是gDNA(基因组DNA)、cDNA(互补DNA)或DN***段。DNA可直接从细胞中获得。此外,为检测DNA表达,可以从细胞获得mRNA,然后通过进行逆转录酶PCR从该mRNA获得cDNA。
[0034]随后,检测c-Met基因的方法可以包括使样品与选自由以下组成的组中的至少一个引物-探针组混合以制备混合样品:包括含有SEQIDNO:1的核酸的引物、含有SEQIDN0:2的核酸的第二引物以及含有SEQIDN0:7的核酸的可裂解探针的第一引物-探针组;包括含有SEQIDN0:3的核酸的引物、含有SEQIDN0:4的核酸的引物以及含有SEQIDN0:8的核酸的可裂解探针的第二引物-探针组;包括含有SEQIDN0:5的核酸的引物、含有SEQIDN0:6的核酸的引物以及含有SEQIDN0:9的核酸的可裂解探针的第三引物-探针组。
[0035]可裂解探针可以在其两端或内部标记有可检测物质,并且可以标记有包括荧光供体和荧光受体的荧光共振能量转移(FRET)对。
[0036]随后,检测c-Met基因的方法可以包括使聚合酶、RNA酶和扩增缓冲液使混合样品混合以扩增混合物中的DNA。可以使用任何热稳定聚合酶或RNA酶。
[0037]本文中所使用的术语"扩增缓冲液"是指被添加到扩增反应中以控制扩增反应并因此改变扩增反应中至少一个要素的稳定性、活性和
/或生命周期(lifecycle)的复合物(混合物、化合物,compound)。扩增缓冲液可以与PCR扩增和RNaseΗ切割活性相容。例如,缓冲液的实例包括含有4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、3-(Ν-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)、乙酸盐或磷酸盐的缓冲液,但不限于此。
[0038]PCR缓冲液通常包括约70mM或更低的KC1,,以及约50至约200μΜ的dATP、dCTP、dGTP和dTTP的每种。缓冲液可进一步包含用于更有效的逆转录酶PCR或优化PCR的添加剂。
[0039]添加剂是指为了改变组合物的至少一个要素的稳定性、活性和/或生命周期而添加的化合物。添加剂的实例包括可以改变扩增效率的甜菜碱、甲酰***、KC1、CaCl2、MgOAc、MgCl2、NaCl、NH40Ac、Nal、Na(C03)2、LiCl、MnOAc、NMP、海藻糖、二甲亚砜(DMS0)、甘油、乙二醇、二硫苏糖醇(DTT)、焦磷酸酶、无机焦磷酸酶(TAP)、阳离子、以及其他化合物、蛋白质或辅因子,但不限于此。可以选择地加入添加剂以促进引物退火的选择性。
[0040]随后,检测c-Met基因的方法可包括检测由探针上的标记发射的信号的增加。发射的信号可以是突光。可以通过使用适当的装置如AppliedBiosystems7500FastReal-TimePCR系统或BioradCFX96real-timePCR热循环仪检测荧光发射的结果,但可