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使用内部对照定量人类dna的方法
本发明涉及用于定量和/或检测样品中基因组的一种或多种核酸的方法,其中在扩增反应中,(i)对第一核酸进行扩增,被扩增的基因座是基因组中的多拷贝基因座(MCL),其中所述基因座在80个碱基对的区段内与SEQ?ID?%的序列同一性,并且所述多拷贝基因座在至少两个不同染色体上具有拷贝,(ii)也对作为内部对照(IC)添加的第二核酸进行扩增,以及(iii)测定来自于所述第一核酸的扩增的扩增产物的量。
【专利说明】使用内部对照定量人类DNA的方法
发明领域
[0001]本发明属于分子生物学、诊断学领域,更具体来说属于分析和法医学领域。本发明还属于核酸扩增和定量领域,更具体来说属于DNA定量领域。
[0002]此外,DNA污迹中不同贡献者的存在的早期评估,通常是调查期间非常重要的信息部分。在这种情况下,由于多个贡献者的干扰,STR分析将引起困难。
[0003]混合样品的具体实例是含有女性和男性DNA混合物的性侵犯污迹。男性:女性DNA比例的准确测定帮助选择最适的下游STR分析。在可获得的罪犯DNA的量非常低的情形中,可以执行针对专一存在于Y染色体上的遗传元件的特定类型的
STR分析,从而排除女性贡献物的干扰。
【背景技术】
[0004]从法医样品以及其他样品回收的DNA的量的測定,不仅在总体DNA分型方法中,而且在各种其他科学领域中的DNA检测中,都是关键的步骤。为了使用例如多重DNA分型试剂盒产生最优结果,。因此,为了确保阳性结果确实是阳性结果,和/或阴性结果确实是由不存在DNA造成的阴性結果,DNA的定量是绝对重要的。此外,用于法医DNA测试实验室的标准品的质量,需要人类特异性DNA定量。这是由于分离技术可能回收人类DNA以及细菌和其他外源DNA。为了对人类特异性DNA进行定量,已经开发了许多程序步骤,包括起始印迹(start-blot)技术、基于液体的杂交测定法和实时PCR(聚合酶链反应)。目前,实时PCR由于其宽的动态范围并易于自动化,是主导技术。
[0005]现代STR试剂盒已变得越来越灵敏,即使在使用少量DNA时也能获得良好結果。因此,对于即使在低度浓缩的`样品中也允许精确和准确定量人类DNA的方法、试剂盒和核酸区域,存在着需求。已经有ー些定量和检测试剂盒可用,然而它们具有严重缺点。一种这样的试剂盒是QuantifilerHuman试剂盒(AppliedBiosystems),另ー种试剂盒是QuantifilerDuo试剂盒(AppliedBiosystems),另一种试剂盒是
PlexorHY实时PCR定量试剂盒(Promega)。QuantifilerDuo试剂盒和PlexorHY试剂盒两者祀向基因组上的常染色体和性染色体(Y染色体)靶点。
[0006]试剂盒的缺点:根据LaSalle等,(ForensicScienceInternational:Genetics,“通过实时聚合酶链反应进行DNA定量的单拷贝和多拷贝方法的分析,,(AnalysisofSingleandMult1-copyMethodsforDNAQuantificationbyReal-TimePolymeraseChainReaction)),Quantifiler试剂盒在定量上更准确,但是与PlexorHY相比具有较低的动态范围。PlexorHY由于扩增多拷贝靶而提供更高的动态范围,但是具有较低准确性。这种较低的准确性可以归因于多拷贝靶。如果对基因组上全套少于20个拷贝进行扩増,由于例如靶拷贝数的不稳定性,则常染色体与性染色体(Y)靶的扩增之间的比率可能变化。PlexorHY试剂盒的动态范围略好于另ー试剂盒(LaSalle等,ForensicScienceInternational:Genetics,“通过实时聚合酶链反应进行DNA定量的单拷贝和多拷贝方法的分析”(AnalysisofSingleandMult1-copyMethodsforDNAQuantificationbyReal-TimePolymeraseChainReaction))。在统计学I:匕较中,LaSalle等证实了这两种试剂盒之间的显著差异。
[0007]法医学中的另ー个重要參数是必须进行分析的DNA的降解等级。由于QuantifilerHuman和PlexorHY试剂盒的扩增子大小在
62至133个碱基对(bp)之间变化,因此当将试剂盒应用于降解的DNA时,预计可能出现显著差异。此外,抑制剂必须被考虑在内。有可能反应中存在DNA,但由于抑制性物质的存在而没有获得結果。
[0008]发明概述
[0009]本发明解决了上面认识到的问题,并提供了下面概述的解决方案。
[0010]本发明涉及用于定量和/或检测样品中基因组的ー种或多种核酸的方法,其中在扩增反应中,(a)对第一核酸进行扩增,被扩增的基因座是基因组中的多拷贝基因座(MCL),%的序列同一性,并且其中所述多拷贝基因座在至少两个不同染色体上具有拷贝,(b)也对作为内部对照添加的第二核酸进行扩增,以及(c)测定来自于所述第一核酸的扩增的扩增产物的量。[0011]本发明还涉及用于扩增所述第一核酸(MCL)的引物和引物对。
[0012]此外,本发明涉及用于扩增所述第二核酸(IC)的引物和引物对。
[0013]此外,本发明涉及用于扩增所述第三核酸(MCL-Y)的引物和引物对。
[0014]它们可以在试剂盒中。因此,本发明还涉及用于检测和/或定量人类核酸的试剂盒。
[0015]在本文中,所述第一核酸是在下面更详细概述的多拷贝基因座,并且通常被称为“MCL”。
[0016]在本文中,所述第二核酸是在下面更详细概述的内部对照,并且通常被称为“1C”。
[0017]在本文中,所述第三核酸是在下面更详细概述的Y染色体上的多拷贝基因座,并且通常被称为“MCL-Y”。
[0018]发明详述
[0019]正如上面概述的,人类DNA的定量和检测是困难的。通常,抑制性物质产生PCR阴性結果,即使在样品中实际存在足够量的用于扩增的DNA。
[0020]本发明解决了这个问题。它涉及一种用于定量和/或检测样品中基因组的ー种或多种核酸的方法,其中在扩增反应中,Ca)对第一核酸进行扩增,被扩增的基因座是基因组中的多拷贝基因座(MCL),%的序列同一性,并且其中所述多拷贝基因座在至少两个不同染色体上具有拷贝,(b)也对作为内部对照添加的第二核酸进行扩増,以及(C)測定来自于所述第一核酸的扩增的扩增产物的量。
[0021]令人吃惊的是,本发明人发现,当用于核酸检测和/或定量时,不是重复元件的多拷贝基因座优于其他基因座。众所周知,重复元件的拷贝数在不同个体之间可能不同。一般来说,这些核酸可以具有任何来源,原核或真核等。优选地,它们是哺乳类动物的,更优选地为人类的。这是因为本发明的ー个极大优点是它在法医学领域中的应用。
[0022]。本发明人令人吃惊地发现,这ー序列和/或与其具有序列相似性的序列可以在人类基因组中被多次发现。
[0023]分布在整个基因组中的序列不都是完全同一的。重要的是所选引物也结合于几乎同一的序列。因此,理想情况下,%、70%、80%、90%或甚至95%或98%的序列同一性。
[0024]两个序列之间的同一‘丨生百分数的确定使用Karlin和Altschul的数学算法来实现((1993)90:5873-5877)。这样的算法是Altschul等(.(1990)215:403-410)的BLASTN和BLASTP程序的基础。使用BLASTN程序,分值=100,字长=12来进行BLAST核苷酸搜索,。为了获得用于比较目的的带间隙的比对,如Altschul等(NucleicAcidsRes.(1997)25:3389-3402)所述使用带间隙的BLAST。当使用BLAST和带间隙的BLAST程序吋,使用相应程序的缺省參数。
[0025]本发明的ー个方面是对多个拷贝进行扩増。理想情况下,扩增各个染色体上的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29
个拷贝。。这不仅是令人吃惊地,而且为本发明的方法提供了能力。此外,拷贝可以在各个染色体例如1、4、5、7、11、16号染色体上发现。
[0026]重要的是应该指出,。,。优选情况下,它们ー起使用在ー种方法中。
[0027]Y染色体上的多拷贝基因座:
[0028]令人吃惊的是,本发明人还已发现,当用于核酸检测和/或定量吋,由于可以提高反应的灵敏度,因此Y染色体上的多拷贝基因座优于其他基因座。这是因为本发明的ー个极大优点是它在法医学领域中的应用。
[0029]。本发明人令人吃惊地发现,该序列和/或与其具有序列相似性的序列可以在Y染色体上被多次发现。
[0030]本发明还涉及用于定量和/或检测样品中基因组的ー种或多种核酸的方法,其中在扩增反应中,
[0031],被扩增的基因座是基因组中Y染色体上的多拷贝基因座(MCL),%的序列同一
,I"生,
[0032](IC)添加的第二核酸进行扩增,
[0033]。
[0034]分布在整个Y染色体中的序列不都是完全同一的。重要的是所选引物也结合于几乎同一的序列。因此,理想情况下,%、70%、80%、90%或甚至95%或98%的序列同一性。
[0035]性侵犯样品的法医学工作流程建议在进行STR反应之前对男性DNA进行定量。这样做首先是为了帮助决定必须使用何种STR试剂盒进行遗传分析,然后是为了确定从例如犯罪现场收集的样品获得多少DNA,以及在STR反应中应该使用多少这样的DNA。有不同的STR试剂盒可用,典型的STR试剂盒检测不同常染色体上的遗传长度多态性,但是在某些情况下,例如使用性侵犯样品时,专门在Y染色体上进行长度多态性分析可能是有利的,因为女性DNA不具有Y染色体。
[0036]典型的STR反应在一定的模板DNA范围内工作最佳,并且整个分析劳动密集性非常高,因此需要在STR分析中确保非常高的成功率的方法学。因此,如果定量试剂盒能够使用户不仅明确鉴定存在的DNA的量,而且能够评估抑制剂的不存在,将是真正的优势,其中所述抑制剂可能损害STR反应的结果,可能引起有价值的样品材料的失效或损失,所述有价值的样品材料在观察到严重抑制的情况下可以被进ー步纯化。
[0037]理想情况下,第三核酸(MCL-Y)的扩增产物的长度在60个碱基对至200个碱基对之间、80至300个碱基对之间、100至200个碱基对之间或120至180个碱基对之间。
[0038]在优选实施方式中,第三核酸(MCL-Y)的长度约为130个碱基对(+/_20%)。
[0039]本发明的ー个特点是用于检测PCR抑制剂的新的内部对照(1C)。IC与一种或多种特定靶在同一反应管中平行地共同扩增。IC被用于检测反应中的PCR抑制剂。因此,可以通过实时PCR中循环阈值的迁移来检测的IC抑制,是反应中存在一定量PCR抑制剂的标
[0040]法医学工作流程建议在进行STR反应之前对DNA进行定量。这样做是为了确定从例如犯罪现场收集的样品获得多少DNA,以及在STR反应中应该使用多少这样的DNA。典型的STR反应在一定的模板DNA范围内工作最佳,并且整个分析劳动密集性非常高,因此需要在STR分析中确保非常高的成功率的方法学。因此,如果定量试剂盒能够使用户不仅明确鉴定存在的DNA的量,而且能够评估抑制剂的不存在,将是真正的优势,其中所述抑制剂可能损害STR反应的结果,可能引起有价值的样品材料的失效或损失,所述有价值的样品材料在观察到严重抑制的情况下可以被进ー步纯化。
[0041]在本发明中,所述IC的性质是令人吃惊地,以至于使其适合于最新的法医学流程,它不仅报告抑制剂的存在,而且还给出良好的定量结果,当抑制剂以不重要的水平存在时在全部
DNA浓度范围内提供稳定的内部对照Ct值,并且对于严重影响STR反应的抑制剂具有高的关联性水平。最近引入市场的ー些新一代STR试剂盒与以前引入的试剂盒相比表现出提高的抑制剂耐受性。通过提供1C,所述IC仅报告对随后的STR反应的成功来说重要的抑制水平,已对这些新的STR试剂盒进行了进ー步开发以提供对PCR抑制剂的更高的耐受性,其还提供了对DNA定量方法学的新要求。
[0042]本发明的IC带有在样品核酸中不存在的对照DNA序列,允许选择仅仅特异性检测IC的寡核苷酸引物和/或探针。
[0043]在优选实施方式中,IC是带有对照DNA序列的PCR产物或质粒。或者,IC也可以是合成的长寡核苷酸(1ngmer)或质粒或任何其他类型的载体。
[0044]在优选实施方式中,也测定第二核酸的扩增产物的量。
[0045]扩增方法是非等温法或等温法。
[0046]非等温扩增方法可以选自聚合酶链反应(PCR)(Saiki等(1985)Science230:1350)、定量实时PCR(rtPCR)、连接酶链反应(LCR)(Landegren等(1988)Science241:1077-1080)。聚合酶链反应扩增是优选的。
[0047]等温扩增方法可以选自解旋酶依赖性扩增(HDA)(Vincent