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使用凝胶渗透色谱法纯化病毒的方法
本发明提供了用于使用凝胶渗透色谱法纯化病毒的洗脱缓冲液和方法。所述方法可用于例如增大病毒从凝胶渗透色谱柱上的回收率。用于所述方法中的缓冲液包括至少一种选自组氨酸或蔗糖、二价阳离子、非离子型洗涤剂和磷酸盐缓冲盐水的赋形剂。
【专利说明】使用凝胶渗透色谱法纯化病毒的方法
[0001]优先权申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年4月29日提交的美国临时申请第61/480,561号的优先权,该美国临时申请全文以引用的方式并入本文。
[0003]背景
[0004]病毒制造包括使用例如诸如凝胶渗透色谱法的色谱方法纯化病毒的步骤。虽然色谱方法是纯化病毒的有效方式,但是这些方法可能会导致病毒在色谱柱上遭到大量损失。因此,使用此类方法的病毒制造成本可能是相当高的。
[0005]概述
[0006]本文提供了用于使用凝胶渗透色谱法纯化病毒的洗脱缓冲液和方法。该方法可用于例如在病毒制造期间增大病毒从凝胶渗透色谱柱上的回收率。
[0007]本文所描述的纯化病毒的方法包括使凝胶渗透色谱柱与包含病毒和液体载体的病毒制品接触,其中病毒保留在凝胶渗透色谱柱上,以及用包含至少一种赋形剂、二价阳离子和磷酸盐缓冲盐水的洗脱缓冲液从凝胶渗透色谱柱上回收病毒。在这些方法中,所述至少一种赋形剂包含组氨酸或蔗糖。液体载体任选地为洗脱缓冲液。任选地,所述至少一种赋形剂包含甘露糖醇或山梨糖醇中的一者或多者。二价阳离子任选地为
Mg2+。任选地,Mg2+以***化镁形式存在。
[0008]磷酸盐缓冲盐水可包括一种或多种磷酸盐与一种或多种***盐的组合。任选地,所述一种或多种磷酸盐包括磷酸二钠和/或磷酸二氢钾。任选地,所述一种或多种***盐包括***化钠和/或***化钾。
[0009]洗脱缓冲液可进一步包括非离子型洗涤剂,例如,聚山梨酯80。任选地,洗脱缓冲液包括甘露糖醇、组氨酸、山梨糖醇、聚山梨酯80和MgCl2,并且磷酸盐缓冲盐水包括磷酸二钠、磷酸二氢钾、***化钠和***化钾。任选地,洗脱缓冲液包括蔗糖、聚山梨酯80和MgCl2,并且磷酸盐缓冲盐水任选地包括磷酸二钠、磷酸二氢钾、***化钠和***化钾。
[0010]包括在本文所描述的病毒制品中的病毒可以为,例如,溶瘤病毒和/或非包膜病毒。本文提供了病毒制品,其中病毒为呼肠孤病毒,例如哺乳动物呼肠孤病毒。哺乳动物呼肠孤病毒的实例为人呼肠孤病毒,例如血清3型病毒(例如,Dearing株呼肠孤病毒)。呼肠孤病毒任选地为重组的呼肠孤病毒、重排
(reasserted)的呼肠孤病毒,或IDAC#190907-01o本文还描述了根据这些方法制备的纯化的病毒制剂。本文所描述的方法可进一步包括将病毒储存在洗脱缓冲液中。
[0011]本文还提供了包括凝胶渗透色谱柱和洗脱缓冲液的装置。洗脱缓冲液包括至少一种赋形剂、二价阳离子和磷酸盐缓冲盐水,并且所述至少一种赋形剂包括组氨酸或蔗糖。凝胶渗透色谱柱任选地用所述缓冲液平衡。任选地,所述装置进一步包括包含病毒和液体载体的病毒制品。
[0012]本文进一步提供了纯化的病毒制剂,其包括从凝胶渗透色谱柱上洗脱的病毒及与凝胶渗透色谱介质接触的洗脱缓冲液。在一些实例中,洗脱缓冲液包含至少一种赋形剂、二价阳离子和磷酸盐缓冲盐水,并且所述至少一种赋形剂包含组氨酸或蔗糖。[0013]本文还提供了凝胶渗透色谱洗脱缓冲液。在一些实例中,洗脱缓冲液可包括至少一种赋形剂、二价阳离子、非离子型洗涤剂和磷酸盐缓冲盐水。在一些实例中,至少一种赋形剂包含组氨酸或蔗糖,并且洗脱缓冲液为凝胶渗透色谱洗脱缓冲液。任选地,洗脱缓冲液包括蔗糖、MgCl2、聚山梨酯80和磷酸盐缓冲盐水。任选地,洗脱缓冲液包括甘露糖醇、组氨酸、山梨糖醇、MgCl2、聚山梨酯80和磷酸盐缓冲盐水。
[0014]本文进一步提供了增大病毒从凝胶渗透色谱柱上的回收率的方法。所述方法包括使凝胶渗透色谱柱与包含病毒和液体载体的病毒制品接触,其中病毒保留在凝胶渗透色谱柱上,以及用包含至少一种赋形剂、二价阳离子和磷酸盐缓冲盐水的洗脱缓冲液从凝胶渗透色谱柱上回收病毒,其中
所述至少一种赋形剂包含组氨酸或蔗糖。在这些方法中,病毒回收率比用磷酸盐缓冲盐水洗脱的病毒的回收率高至少约20%。任选地,病毒回收率比用磷酸盐缓冲盐水洗脱的病毒的回收率高至少约25%(例如,比用磷酸盐缓冲盐水洗脱的病毒的回收率高至少约30%或比用磷酸盐缓冲盐水洗脱的病毒的回收率高至少约35%)。
[0015]一个或多个方面的细节在下面的描述中示出。根据该描述和权利要求书,其他特征、目的和优点将是明显的。
[0016]详述
[0017]本文描述了用于使用凝胶渗透色谱法纯化病毒的洗脱缓冲液和方法。凝胶渗透色谱法(即,凝胶过滤或尺寸排阻色谱法)是用于将混合物的组分根据它们的尺寸分离的扩散控制过程。本文所描述的凝胶渗透色谱洗脱缓冲液可用于,例如增大在病毒制造期间病毒从凝胶渗透色谱柱上的回收率。本文所描述的洗脱缓冲液包括一种或多种赋形剂、二价阳离子、非离子型洗涤剂和磷酸盐缓冲盐水。
[0018]本文所提供的洗脱缓冲液包括至少一种赋形剂(例如,一种、两种、三种、四种或更多种赋形剂)。用于洗脱缓冲液中的赋形剂包括但不限于,糖和氨基酸。用于本文所描述的洗脱缓冲液中的合适糖的实例包括蔗糖。用于本文所描述的洗脱缓冲液中的
合适氨基酸的实例包括组氨酸。任选地,本文所描述的洗脱缓冲液包括组氨酸或蔗糖中的至少一者。
[0019]用于本文所描述的洗脱缓冲液中的合适糖包括,例如,单糖和二糖。在一些实例中,洗脱缓冲液包括蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇,或这些的组合。合适糖的进一步实例包括乳糖、右旋糖、果糖、葡萄糖和麦芽糖。任选地,洗脱缓冲液基本上不含海藻糖。%、%、%、%,或0%的海藻糖,以洗脱缓冲液的重量为基准。在一些实例中,洗脱缓冲液基本上不含除蔗糖以外的糖(即,洗脱缓冲液基本上不含非-蔗糖多元醇)。
[0020]用于洗脱缓冲液中的糖可包括一种糖,或两种或更多种糖的组合。例如,洗脱缓冲液可包括蔗糖作为缓冲液中存在的糖。任选地,洗脱缓冲液可包括甘露糖醇或山梨糖醇中的一者或多者(例如,甘露糖醇与山梨糖醇的组合)作为缓冲液中存在的一种(多种)糖。洗脱缓冲液中存在的一种(多种)糖的总浓度可为10重量%或更少,以洗脱缓冲液重量为基准。例如,以洗脱缓冲液重量为基准,%(例如,%、%、低于
%、%、低于7重量%、低于6重量%、低于5重量%、低于4重量%、低于3重量%、低于2重量%,或低于I重量%,以洗脱缓冲液的重量为基准)。例如,以洗脱缓冲液的重量为基准,%至5重量%、从I重量%%、从2重量%至4重量%的浓度(例如,3重量%),或所列举范围内的任何量存在于洗脱缓冲液中。任选地,以洗脱缓冲液的重量为基准,%(例如,7%)的组合浓度包括在洗脱缓冲液中。例如,以洗脱缓冲液的重量为基准,%%(例如,%至7%、从1%至6%、从2%至5%,或从3%至4%)的浓度包括在其中,%%(例如,%至7%、从1%至6%、从2%至5%,或从3%至4%)的浓度包括在其中,使得糖的组合浓度低于
%。
[0021]氨基酸也可包括在本文所描述的洗脱缓冲液中。合适的氨基酸包括,例如,组氨酸、精氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酸,或这些的混合物。以洗脱缓冲液重量为基准,一种或多种氨基酸可以以5%或更低的浓度存在于洗脱缓冲液中。例如,%或更低、%或更低、%或更低、%或更低、%或更低、%或更低、%或更低、%或更低,%或更低。
[0022]如本文所描述,二价阳离子也包括在本文所描述的洗脱缓冲液中。用于洗脱缓冲液中的合适的二价阳离子包括镁阳离子(即,Mg2+)。可将Mg2+与阴离子组合以诸如MgCl2的盐形式引入到洗脱缓冲液中。在一些实例中,二价阳离子引入盐可为水合物(即,将二价阳离子引入到缓冲液中的盐可含有与金属中心结合或与络合物一起结晶的水分子)。水合物可为,例如,一水合物、二水合物、三水合物、四水合物、五水合物、六水合物,或七水合物。例如,可将Mg2+以MgCl2?6H20形式引入到洗脱缓冲液中。任选地,洗脱缓冲液基本上不含Zn2+。。例如,Mg2+、、ImM至3mM的浓度(例如,2mM),或所列举范围内的任何浓度以MgCl2或MgCl2?6H20形式存在于病毒制剂中。任选地,排除磷酸盐缓冲盐水组分,洗脱缓冲液中的赋形剂可基本上不含一价阳离子盐,例如,含有钠(Na+)、锂(Li+)、钾(K+)和铵(NH4+)的盐。
[0023]洗涤剂也可包括`在本文所描述的洗脱缓冲液中。洗涤剂是指具有亲水性部分与疏水性部分的组合的物质。用于本文所描述的洗脱缓冲液中的合适洗涤剂包括离子型和非离子型洗涤剂。在一些实例中,聚山梨酯80任选地以非离子型洗涤剂形式包括在洗脱缓冲液中。以洗脱缓冲液重量为基准,一种或多种洗涤剂可以任选地以低于I重量%的量存在于洗脱缓冲液中。例如,一种
(多种)%、%,或低于
%(例如,%)的量存在于洗脱缓冲液中。
[0024]任选地,洗脱缓冲液基本上不含羧酸盐。羧酸盐的实例包括琥珀酸盐和柠檬酸盐。
[0025]如上所描述,本文提供的洗脱缓冲液进一步包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)。磷酸盐缓冲盐水可包括,例如,一种或多种磷酸盐、一种或多种***盐,或这些的组合。任选地,所述一种或多种磷酸盐包括磷酸二钠和/或磷酸二氢钾。用于洗脱缓冲液中的合适***盐的实例包括***化钠和/或***化钾。用于制备磷酸盐缓冲盐水的盐任选地为水合物。如上所描述,水合物可为,例如,一水合物、二水合物、三水合物、四水合物、五水合物、六水合物,或七水合物。例如,用于制备磷酸盐缓冲盐水的磷酸二钠可为磷酸二钠七水合物(即,Na2HPO4?7H20)。
[0026]用来制备用于洗脱缓冲液中的磷酸盐缓冲盐水的盐的示例性组合包括磷酸二钠七水合物(即,Na2HPO4?7H20)、磷酸二氢钾(即,KH2PO4X***化钠(即,NaCl),和***化钾卿,KC1)。任选地,Na2HPO4?7H20可以以足以在磷酸盐缓冲盐水中提供从5mM至15mM的浓度或其间任何量的Na2HPO4?7H20的量使用。例如,Na2HPO4?(例如,),
或其间任何量的Na2HPO4*7H20的量使用。任选地,,或其间任何量的KH2PO4的量使用。例如,(例如,),或其间任何量的KH2PO4的量使用。任选地,NaCl可以以足以在磷酸盐缓冲盐水中提供从75mM至200mM的浓度或其间任何量的NaCl的量使用。例如,NaCl可以以足以提供从IOOmM至175mM或从125mM至150mM的浓度(例如,137mM)或其间任何量的NaCl的量使用。任选地,。例如,(例如,)或其间任何量的KCl的量使用。
[0027]用于形成如本文所描述的洗脱缓冲液的赋形剂、二价阳离子、洗涤剂和磷酸盐缓冲盐水的示例性组合包括甘露糖醇、组氨酸、山梨糖醇、MgCl2、聚山梨酯80和磷酸盐缓冲盐水。以洗脱缓冲液重量为基准,山梨糖醇可以以低于3%的浓度存在。例如,%、%、%、%、%、%、%、%、%、低于2%、%、%、%、%、%、%、低于
%、%、%,或低于1%的浓度存在。在一些实例中,以洗脱缓冲液重量为基准,甘露糖醇与山梨糖醇的组合浓度低于
10%。例如,甘露糖醇的浓度可为3%,而组氨酸的浓度可为2%从而提供5%的组合浓度。%的量(例如,%)存在。在一些实例中,磷酸盐缓冲盐水可包含磷酸二钠、磷酸二氢钾、***化钠和***化钾。进一步地,洗脱缓冲液可基本上不含一价阳离子盐、Zn2+,和/或海藻糖。
[0028]另一种合适的洗脱缓冲液包括蔗糖、MgCl2、聚山梨酯80和磷酸盐缓冲盐水。任选地,以洗脱缓冲液重量为基准,蔗糖以低于5%的浓度存在。例如,以洗脱缓冲液重量为基准,%或更低、4%或更低、%或更低、3%或更低、%或更低,或2%或更低的浓度存在。在这些实例中,磷酸盐缓冲盐水可包含磷酸二钠、磷酸二氢钾、***化钠和***化钾。此外,洗脱缓冲液可基本上不含一价阳离子盐、非-蔗糖多元醇,和羧酸盐(例如,琥珀酸盐和柠檬酸盐)。
[0029]本文所描述的洗脱缓冲液可用作用于在例如病毒制造期间纯化病毒的凝胶渗透色谱洗脱缓冲液。如本文所描述的纯化病毒的方法包括使凝胶渗透色谱柱与包括病毒和液体载体的病毒制品接触。
[0030]用于本文所描述的病毒制品中的病毒包括包膜和非包膜病毒。包膜和非包膜病毒可为DNA病毒、RNA病毒,或逆转录病毒。任选地,用于本文所描述的病毒制品中的病毒为非包膜病毒。非包膜病毒包括,例如,属于以下病毒科家族的病毒