使用光的核酸的扩增抑制方法和高灵敏度的选择性核酸扩增方法.docx

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专利名称:使用光的核酸的扩增抑制方法和高灵敏度的选择性核酸扩增方法
技术领域:
本发明涉及使用包含光连接性核酸类的发夹探针(clampprobe)选择性地检测例如野生型核酸中混杂的突变型核酸的方法和试剂盒、以及具有350380nm范围的波长的光照射功能的核酸扩增装置。
背景技术:
人基因组序列解读完毕后,将所解读的基因信息有效用于诊断等医疗领域的活动进行活跃。解读基因组序列之后,接下来所关注的是基因表达模式分析或基因中的单碱基替换(一塩基置換)(SNPs)的分析等。研究在各种条件下表达的基因的表达量或基因突变,由此基因的功能或基因与疾病或药物感受性的关联日益明朗,因此与所累积的基因有关的信息不仅被用于疾病的诊断,还被用于治疗方法的选择。其中,单核苷酸多态性(一塩基多型)或突变成为疾病诊断或风险判定等基因检查中的重要目标,在涉及糖尿病、风湿病、恶性肿瘤、精神疾病、心脏病等多个方面的领域应用。作为该单碱基替换的检测方法,迄今为止开发了各种方法。具体而言,作为快速且高通量地进行分析的方法,可以列举:Invader
法、SniPer法、TaqManPCR法、杂交探针法、SNPIT法、焦磷酸微测序法(Pyrominisequencing法)、变性高效液相色谱(DHPLC)法、MALD1-T0F/MS法、NanoChip法等。在恶性肿瘤领域,狙击体内的特定分子以抑制其功能的分子靶向治疗药的开发在积极进行,选择治疗方法时,在确定分子靶向治疗药的使用上,单碱基替换的检测被定位成重要的检查。例如,推荐在使用抗癌药前实施EGFR基因或KRAS基因的突变分析检查。其原因在于:根据是否存在突变,在药效上存在差异,因此考虑突变以指导给药。另外,通过事先研究是否存在这样的突变,与药物的有效性相比,还存在着选择发生严重的副作用的危险性大、给药效果差的患者的目标。根据这样的理由,在恶性肿瘤领域,特别是单碱基替换的检测被视为重要的检查。但是,在恶性肿瘤这样的后发突变的检测中,由于以来自占据多半检体材料的正常细胞的野生型核酸分子为背景(background),因此在上述的分析方法中,往往无法检测单碱基替换等的突变。为了解决这个问题,人们开发了Scorpion-ARMS法或PNA-LNAPCRClamping法(专利文献I)。Scorpion-ARMS法是指,利用以突变点位于引物的3’末端附近的方式与突变型序列一并制备的该引物和另一个引物的组合,选择性地扩增突变型分子,再通过Scorpion法这种荧光检测法分析该扩增产物的方法。PNA-LNAPCRClamping法是指,利用设计在突变点上的与野生型序列互补的发夹引物选择性地封闭
(block)野生型分子,以突变型LNA作为荧光检测探针,选择性地扩增并检测突变型分子的方法。上述方法均利用已形成杂交体(〃47'.;'yK)的引物或探针和模板分子在平衡系统中的热稳定性之差,无论是在引物或探针与模板分子完全互补的情况下形成杂交体、还是在引物或探针与模板分子有I个或多个碱基不互补的情况下形成不完全的杂交体,其不同之处也不过是热稳定性的不同。因此,区别两者的适当的条件根据目标碱基序列而不同,即使在更适当的条件下,使热稳定性发生变化的条件对两者几乎均等地发挥作用。即,只要是仅以平衡系统中的杂交体形成的热稳定性之差作为区别两者的原理,就无法设定在特异性和灵敏度的均衡上妥协的温度条件,而且尚需说明的是,可以设定的温度条件的范围往往非常窄,因此,存在着根据基因序列难以设计探针或引物的情形。鉴于上述检测技术的状况,目前在恶性肿瘤的突变检测检查中,对检查材料的采集设有严密的限制。具体而言,推荐由癌症组织制作病理标本,再由染色标本鉴定肿瘤部位,之后由连续切片的未染色标本只集中在肿瘤部分(关于大肠癌患者的KRAS基因突变测定的指南)。但是,在肿瘤部位的鉴定中,需要组织形态学的专业知识、且操作繁杂,而且在成本方面负担大。因此,人们要求确立不怎么受作为检查要件的检查材料的采集或靶基因的碱基序列所带来的限制、且兼具特异性和灵敏度的检测方法。作为兼具特异性和灵敏度的检测方法,人们
开发了利用光连接性核酸类的突变基因的检测方法。例如,专利文献2中记载着:基于使特定的碱基序列的靶核酸与互补链形成杂交体的原理,同时兼具高特异性和灵敏度来进行检测的方法。其依据于下述方法:由与靶核酸互补的光连接性核酸类和在3’末端或5’末端具有可以与该光连接性核酸类进行光连接的碱基部分的被光连接性核酸类构成,且该核酸类中的任一方具有标记部分、而剩下的一方被固定在基材上的方法。根据该方法,位于同一条链上的光连接性核酸类和被光连接性核酸类利用光连接只在形成完全的杂交体时特异性地进行光连接,可以将具有标记部分的核酸分子以共价键固定在基材上,可以在互补的双链发生解离的条件下进行彻底的清洗,可以兼具高特异性和灵敏度(S/N比)。但是,在检测灵敏度上有限度,该方法的使用目的在于:检测包含在大量的靶核酸中的突变是否存在,但为了检测大量的野生型核酸中混杂的微量突变型核酸,该微量的突变型核酸的存在量往往在检测灵敏度以下,因此无法使用。另外,由于光连接性核酸类与同链的被连接核酸形成共价键,因此还无法扩增想要检测的靶核酸中所含的突变。另一方面,专利文献3中记载着下述方法:首先,通过PCR扩增包含靶核酸的样品,对于该样品,结合专利文献2的方法,检测核酸样品中的具有I个或2个以上的靶核苷酸序列的核酸。当突变型核酸的比例为微量时,即使通过
PCR可以扩增,但与野生型核酸的含有比例也不会发生变化,通过在试管内可以进行检测的范围的扩增,无法将突变型核酸扩增至可以检测的程度。该方法的使用目的在于:检测包含在大量的靶核酸中的突变是否存在,但无法用于检测大量的野生型核酸中混杂的微量突变型核酸。另外,为了通过PCR扩增包含靶核酸的样品,只要在某种程度上提高突变型核酸的含有比例,就有可能检测到突变型核酸,但步骤多、繁杂,无法满足要求快速的检查结果的临床现场的迫切需要。现有技术文献专利文献
专利文献1:日本专利第4216266号说明书;
专利文献2:W02007/058326号公报;
专利文献3:日本特开2009-213445号公报。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供:在核酸样品中,检测野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸时,快速而简便,且兼具高特异性和灵敏度的方法。解决课题的方法
本发明人为了解决上述课题反复进行了深入研究,结果发现:通过将包含光连接性核酸类的发夹探针与具有靶位点序列的野生型核酸进行光连接,可以选择性地阻止野生型核酸的扩增,所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸的序列的靶位点互补的序列。即,通过使用光连接性发夹探针,只在形成完全的杂交体时特异性地进行光连接,在核酸扩增反应中的温度循环的任一个步骤中也保持连接、即处于非平衡状态,从而可以阻止靶分子在核酸扩增反应中作为模板的作用。由此,可以兼具野生型核酸的高聚集
(々9>C7,clumping)(抑制)效果和突变型核酸的选择性(特异性)核酸扩增。本发明涉及下述[I][15]:
[1]使具有靶位点的核酸、与包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类的发夹探针共存,通过光照射使该具有靶位点的核酸与该发夹探针进行光连接,抑制由核酸扩增法引起的包含靶位点的检测区的扩增的方法;
[2]突变型核酸检测方法,该方法通过选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区,来检测是否存在该突变型核酸,该方法包括下述步骤:
步骤(a):使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存,使发夹探针与具有靶位点的野生型核酸分子特异性地形成杂交体,所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列;
步骤(b):对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射,使之进行光连接;步骤(C):将上述步骤(a)、(b)的反应产物供给核酸扩增反应;
步骤(d):分析上述扩增产物;
[3]突变型核酸检测方法,该方法通过选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区,来检测是否存在该突变型核酸,该方法包括下述步骤:
步骤(a):使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存,使发夹探针与具有靶位点的野生型核酸分子特异性地形成杂交体,所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列;
步骤(b):对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射,使之进行光连接;步骤(C):在核酸扩增反应中进行上述步骤(a)、(b);
步骤(d):分析上述扩增产物;
[4][I][3]中任一项的方法,其中,上述核酸扩增法为PCR法;
[5][I][3]中任一项的方法,其中,上述核酸扩增法为实时PCR法;
[6][I][3]中任一项的方法,其中,上述发夹探针具有与靶核酸分子的有义链和/或反义链互补的序列;
[7][I][6]中任一项的方法,其中,上述发夹探针的链长为730;
[8][I][7]中任一项的方法,其中,上述光照射通过350380nm范围的波长来进行;[1][8]中任一项的方法,其中,上述光照射在通常的互补链彼此之间结合和解离的温度循环中在互补链彼此之间可以结合的温度下进行
I次以上;[1][9]中任一项的方法,其中,上述光照射通过赋予了350380nm范围的波长的光照射功能的核酸扩增装置来进行;试剂盒,其中包含发夹探针和扩增包含靶位点的检测区的引物,所述发夹探针包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类,该试剂盒抑制由基因扩增法引起的包含靶位点的检测区的扩增;突变型核酸检测试剂盒,其中包含发夹探针和扩增包含靶位点的检测区的引物,所述发夹探针包含具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列的光连接性核酸类,该试剂盒通过选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区,来检测是否存在该突变型核酸;核酸扩增装置,该装置具有350380nm范围的波长的光照射功能;核酸扩增装置,该装置具有350380nm范围的波长的光照射功能,该装置包括下述步骤:
步骤(a):使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存,使发夹探针与具有靶位点的核酸分子特异性地形成杂交体,所述光连接性核酸类具有与靶位点互补的序列;步骤(b):对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射,使之进行光连接;步骤(C):将上述步骤(a)、(b)的反应产物供给核酸扩增反应;核酸扩增装置,该装置具有350380nm范围的波长的光照射功能,该装置包括下述步骤:
步骤(a):使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存,使发夹探针与具有靶位点的核酸分子特异性地形成杂交体,所述光连接性核酸类具有与靶位点互补的序列;步骤
(b):对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射,使之进行光连接;步骤(C):在核酸扩增反应中进行上述步骤(a)、(b)。发明效果
根据本发明,可以兼具高灵敏度和特异性、且快速及简便地检测核酸样品中是否存在混杂的突变型核酸。
图1是3-***基乙烯基咔唑-1’-脱氧核苷(CNVK)的结构式;
图2是显示实施例1中实施的、使用LightCycler确认是否存在由光连接反应引起的野生型基因的PCR扩增抑制的结果的曲线图3是显示实施例2中实施的、使用LightCycler确认是否存在由光连接反应引起的突变型基因的PCR扩增抑制的结果的曲线图4是显示实施例4中实施的、通过琼脂糖凝胶电泳确认在PCR扩增反应时进行光连接反应的情况下是否存在突变型基因的选择性扩增的结果的图。泳道I为标志物(φX174HaeIII消化液),泳道2为野生型,泳道3为突变型;
图5是显示实施例5中实施的、使用LightCycler确认作为对照的在PCR扩增反应时未进行光连接反应的情况下突变型基因的检测灵敏度的结果的曲线图6是显示实施例5中实施的、使用LightCycler确认作为比较例的(在PCR扩增反应时未进行光连接反应)PNA-LNAClampPCR反应的突变型基因的检测灵敏度的结果的曲线图7是显示实施例5中实施的、使用
LightCycler确认在PCR扩增反应时进行光连接反应的情况下突变型基因的检测灵敏度的结果的曲线图。
具体实施例方式本发明中,关于DNA、RNA、核酸、基因、基因表达、编码、互补、模板、启动子、探针、弓丨物、杂交、PCR等用语的定义,与目前分子生物学、遗传学、基因工程学等中通常广泛使用的用语意思相同。本发明中,对核酸没有特别限定,只要是DNA或RNA、或后述的核苷酸类似物即可,可以是天然的核酸,也可以是合成的核酸。作为天然的核酸,例如有从生物中回收的基因组DNA、mRNA、tRNA、rRNA、hnRNA等。作为合成的核酸,有利用β~***基乙基亚磷酰***法、DNA固相合成法等公知的化学合成法合成的DNA、或利用PCR等公知的核酸扩增法合成的核酸、利用逆转录反应合成的cDNA等。本发明中,“野生型核酸”是指发生突变之前的核酸,其典型的例子为:未发生突变、且包含具有本来的正常功能的遗传信息的核酸。这里所说的遗传信息不仅包括编码mRNA、tRNA、rRNA、snRNA等信息的转录区,还包括启动子等的基因表达所必需的调节区。本发明中,“突变型核酸”是指发生了突变的核酸。“突变”是指DNA或RNA等的核酸序列的变化,遗传学等中使用的碱基取代(塩基置換)、插入、缺失、逆位、重复、易位等符合。在该突变型核酸中,突变所存在的区域不仅包括转录区,还包括启动子等的基因表达所必需的调节区。需要说明的是,通过突变,突变型核酸未必具有功能上的变化。另外,