作物萌动种子抗热性快速鉴定方法.docx

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专利名称::作物萌动种子抗热性快速鉴定方法
技术领域:
:本发明属于植物学领域,更具体地,本发明涉及一种筛选青菜抗热植株的方法。
背景技术:
:随着全球气候的变暖,人们对温度的关注度越来越高。如何提高植物的抗热性,培育抗热品种以应对高温给农业生产和生态环境的不利影响,是植物科学家需要思考和回答的紧迫问题。一方面,应当通过杂交育种的方法改良植物的抗热性;另一方面,需要从抗热的植物资源中发掘抗热的基因。目前我国蔬菜产业化育种的历史比较短,传统育种技术落后,周期长,效率低,特别是可满足夏季生产需要的自主蔬菜品种更少,怎样利用分子标记的技术加快育种的步伐是一个迫在眉睫的任务。一直以来,抗热性鉴定和筛选是作物抗热育种上的主要难题。在蔬菜抗热性鉴定指标的研究上,本领域人员在以往已经做了大量的工作,然而这些工作确定的鉴定指标主要以生理生化指标为主,鉴定方法比较繁琐,且不够直观,难以实际应用。青菜是我国南方许多地区种植的主要绿叶蔬菜。随着生活水平的不断提高和营养观念的逐渐科学化,人们对青菜的需求量越来越大,其中夏秋季的青菜在绿叶蔬菜中占有相当大的比例。然而,我国现有的青菜品种大多适于秋冬季栽培,夏季高温栽培的青菜品种很少见,对青菜等绿叶蔬菜的生产造成了极大的限制。因此,尽快选育适合夏季高温栽培的品种是一项非常迫切的任务。
发明内容本发明的目的在于提供一种新的青菜植株抗热性鉴定方法一一萌动种子抗热性快速鉴定方法。在本发明的第一方面,提供一种筛选青菜抗热植株的方法,所述方法包括(1)在待测青菜的种子萌发(萌动)阶段,。C热处理60土20分钟,然后转移到适温下培养1-5天;同时设置对照组,自青菜的种子萌发阶段起将种子在适温下培养1-5天;(2)计算抗热指数,(-1),则该植株是抗热植株;其中,所述的抗热指数=热处理植株的胚根长度/对照组植株的胚根长度。在另一优选例中,步骤(1)中,'C热处理60士15分钟;更优选的,。C热处理60土10(更优选60±5)分钟。在另一优选例中,步骤(1)中,所述的适温是28土2。C。在另一优选例中,步骤(1)中,转移到适温下培养2-3天。在另一优选例中,步骤(2)中,,则该植株是抗热植株。在另一优选例中,步骤(1)中,所述的热处理是通过水浴加热实现的。在另一优选例中,在热处理时,将种子置于敞口的容器中,将装有种子的容器置于水浴中进行热处理,并使容器的敞口处于水平面上(即容器中没有水进入)。在另一优选例中,步骤(1)中,热处理后,将种子
转移到湿润的蓬松性介质(如脱脂棉,滤纸等)上,从而胚根穿过介质竖直往下生长,便于测量胚根的长度。在另一优选例中,所述方法还包括(3)对步骤(2)获得的植株培养至苗期的3叶期,在44-5(TC下进行热处理,观察植株的生长情况,进一步确定青菜抗热植株。在另一优选例中,在步骤(l)之前,还包括步骤将青菜的种子迸行浸种,然后置于湿润的介质上催芽,使青菜的种子进入萌发阶段。在本发明的第二方面,提供一种培养青菜抗热植株的方法,所述的方法包括(1)在青菜的种子萌发阶段,。C热处理60±20分钟,然后转移到适温下培养1-5天;同时设置对照组,自青菜的种子萌发阶段起将种子在适温下培养1-5天;(2)计算抗热指数,(-1),则该植株是抗热植株;其中,所述的抗热指数二热处理植株的胚根长度/对照组植株的胚根长度;(3)将(2)中获得的青菜抗热植株移栽到大田中继续培养。本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1显示了最抗热品种华王和最敏感品种小八叶在苗期5(TC高温下的不同反应;其中,左图华王;右图小八叶。图2显示了在4(TC,42'C以及43X:热处理条件下,华王和小八叶热抗指数的差异。图3显示了在44°C,45°C,46°C,47°C以及48°C高热处理条件下华王和小八叶热抗指数的差异。具体实施例方式田间选育植株品种周期长,费工费时,而且环境因素比较复杂,如果能够在早期幼苗阶段就进行初步的鉴定,必将大大减少工作量,縮短选育的时间。本发明人经过深入的研究,首次揭示一种在种子萌发期通过适当高温处理来筛选青菜抗热植株的方法。采用所述的方法处理后,青菜植株可表现出非常显著的抗热性差异,并与植株后期在高温条件下生长的的存活率密切相关。所述的方法耗时短,操作简单
,准确高效。青菜(5ra5^/cflc画/e幼'//"e肌'力,为十字花禾斗芸薹属一年生、二年生草本植物。所述的"抗热植株"是指能够在高温的气候环境下维持生长、发育、成熟的植株,所述的高温一般指空气温度大于35'C(如4(TC),而相应的土壤表面温度可高达45-6(TC。所述的抗热植株能够在夏天生长、发育和成熟。所述的"适温"是指最适合于植株生长的温度,在该温度下,植物处于较佳的生长状态。作为本发明的优选方式,所述的适温在20-32°C;更佳的,所述的适温在26-30°C。6本发明人对于抗热青菜种质资源和抗热基因的研究已经持续了很多年,为此收集和选育了大批有用的育种材料,包括抗热自交系华王和热敏感自交系小八叶等。为了准确、高效地鉴定青菜多种自交系的抗热性,在以往的研究中,本发明人曾经尝试苗期、成株期和花期高温处理,以找到一种可靠的方法,但是未能获得理想的抗热性鉴定结果。进一步深入研究后,本发明人意外地发现,在青菜种子的萌发期,对种子进行适当高温处理,然后在适温
(如28'C)下继续培养2天左右,就可以有效且快速地区分出青菜的抗热性。因此,本发明提供一种筛选青菜抗热植株的方法,所述方法包括(1)在待测青菜的种子萌发阶段,。C热处理60土20分钟,然后转移到适温下培养1-5天;(2)观察植株的生长情况,筛选出青菜抗热植株。所述的"种子萌发",是指种子吸水后打破休眠,撑破种皮露出胚根的过程。种子萌发时,主要表现为以下特征干种子通过吸胀吸水,原生质胶体由凝胶状态转变为溶胶状态,酶蛋白恢复活性,酶促反应与呼吸作用增强,贮藏物质开始转化,胚根、胚芽的细胞生长与分裂使种皮破裂,胚根伸出。观察到种子萌发后,挑选胚根侧露白的种子,用于后续的热处理。本发明人找到了可以最显著地体现种子抗热性差异的热处理温度,。C。'C易于出现死苗现象,'C则无法最显著地体现植株品种的抗热性差异。热处理的时间一般在60土20分钟是较为适宜的。较优选的,步骤(1)中,。C热处理60士15分钟;更优选的,。C热处理60±10分钟;更优选的,。在对萌发的种子进行热处理后,将种子转移到适温下生长。所述的适温是指常规的适合青菜生长的温度,通常是在20-32'C下。在适温下培养1天后,抗热性植株和非抗热性植株的生长差异就可以有所体现,因此可在适温下培养1-10天后,较佳的
l-5天,观察植株的生长情况。优选的,步骤(1)中,将热处理后的种子转移到28士2t:下培养2-3天。作为本发明的特别优选的方式,植株生长情况的判断通过观察植株的胚根生长情况来实现。如果胚根能够继续以一定的速度伸长,则该植株可能是抗热品种。优选的,还同时设置不经过热处理的同种植株对照,通过观察热处理和非热处理的植株的胚根伸长情况来判断该种植株的抗热性。优选的,所述的对照组植株是自青菜的种子萌发阶段起将种子在28土2。C下培养2-3天获得的植株。作为本发明的优选方式,以抗热指数来定量地确定植株的抗热性。所述的抗热指数的计算公式如下抗热指数(HI)-热处理植株的胚根长度/对照组植株的胚根长度根据本发明人长期的、反复的试验,并将植株的抗热指数与之后植株在受热环境下的存活率进行比对,(-1)。,则该植株是抗热植株;优选的,;更优选的,。可以采用多种加热的方式对处于萌发阶段的种子进行热处理,加热的方法是本领域人员已知的。作为本发明的优选方式,使用水浴的加热方式来对种子进行热处理。优选的,将种子置于适当的容器(上端敞开且处于水平面上)中,置于水浴中。经过试验还发现,水浴的热处理方法比采用培养箱通过空气加热种子的方法的热处理效果更优异,采用水浴的方法在抗热品种早期选育中能够很好地反映出品种间差异。这是因为水浴的方法比较接近大田高热土壤的温度和湿度环境,且温度易于控制,受热均匀,结果可重复。在经过热处理后,将种子转移到一般的培养介质中培养,所述的培养介质没有特别的限制,适合于青菜苗期生长的培养介质均是可用的。优选地
,所述的培养介质是湿润的蓬松性介质,例如用水湿润的滤纸或脱脂棉,从而胚根可以穿过所述介质竖直往下生长。本发明人的验证发现,在青菜苗期的3叶期进行热处理也能够一定程度地体现植株的抗热性差异,尽管这种抗热性差异表现不如在种子萌发期进行热处理的抗热性差异明显。因此,在对种子萌发期进行上述筛选的基础上,对筛选出来的植株还可在苗期的3叶期进行进一步的热处理筛选,从而作为判断植株抗热性的进一步参考依据。优选的,在苗期的3叶期进行热处理时,温度可以是44-50。C。作为本发明的优选方式,为了获得处于萌发阶段的青菜种子,将待测青菜的种子浸种(如浸种约1-5小时,较佳的2小时)后置于湿润的介质上催芽,使青菜的种子进入萌发阶段。所述的湿润的介质例如是湿润的滤纸或湿润的脱脂棉。在获得了所述青菜抗热植株后,可将生长到一定阶段的植株移栽到试验田或大田中,继续培养。在本发明的优选实施例中,发明人选择了一种已知的抗热品种华王和一种已知的热敏感品种小八叶,验证它们经过热处理后的抗热性反应。也即,将萌动的青菜种子置于
46'C的高温下催芽1小时,经28'C的适温培养2天,测定胚根长度,以两种温度下胚根长度的比值作为个体抗热水平的抗热指数。结果发现,华王在抗热性上确实表现出明显的优势,而小八叶抗热性不佳。因此,可以确定本方法能够准确地反映华王和小八叶两品种的抗热性差异。本发明的方法适用于鉴定许多青菜自交系和杂交系的抗热性,选择出抗热植株,经后续移栽后验证,本发明的方法准确性高、重复再现性良好。利用本发明的方法,本发明人已经从HR-ll(抗热品种)XHR-31(热敏感品种)杂交的F4群体中鉴定出200个抗热水平不同的株系,并培育出雄性不育抗热杂交品种。本发明的主要优点在于本发明的方法以刚萌发的种子热处理后的热抗指数为衡量指标,简单方便,温度容易控制,短时内(仅需要数天)就能够快速得出判断,可用于品种间的快速比较。并且,本发明的方法准确度高,有广泛的应用价值。下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。(见《上海蔬菜》,2005年第6期)和热敏感9品种小八叶(见《上海蔬菜》,2007年第5期)作为主要的研究对象,同时选用
其它青菜品种和自交系31个(见表l)与上述两个品种比较。,待植株长到3叶、6叶和9叶时转移到人工气候箱内,在40°C,42°C,44°C,46°C,48。C和50'C的温度下培养,观察植株形态的变化。培养时,采用的培养基质是常规的营养土、蛭石、草炭土按1:1:1混和的混合物。,待植株抽薹时转移到人工气候箱内,在40°C,42°C,44°C,46°C,48。C和50°C的温度下培养,观察植株形态的变化。培养时,采用的培养基质是泥炭土和蛭石混和营养土。,分别置于水浴锅中热处理,设3个温度40°C,42°C,43°C,,lh,2h,然后转移至28。C培养1天后再测胚根长度。高热处理方法根据热处理的结果再调整热处理温度和方法将种子播在铺有湿润滤纸的平板上催芽,待种子萌发时挑选胚根侧露白,大小一致的种子播在EP管中,水浴锅热处理设5个温度44°C,45°C,46°C,47°C,48°C,,lh,2h,然后转移至28。C培养3天后再测胚根长度。热抗指数(HI,HeatIndex)以不经热处理,在28'C下培养相同时间、相同品种的植株胚根长作对照,分别计算各品种在不同温度处理下的热抗指数热抗指数
=高温处理下的胚根长/28'C处理下的胚根长热抗指数大于1则表明促进胚根伸长,小于1则是胚根伸长受到抑制。需要说明的是,在热抗指数小于l时,仅能说明热处理后的植株胚根生长受到限制,如果热处理后的植株的胚根还能以一定速度生长和发育,,可认为是抗热植株。,6叶期及9叶期对高温的反应,结果表明在3叶期进行热处理品种间差异最明显,植株越大,对逆境抵抗力越强,差异越小。环境温度在46。C以上时伤害趋于明显。由图l可以看出,5(TC高温下华王植株还能正常生长,表现为抗热品种;而小八叶则叶片焦枯,出现死苗,对高温最为敏感。其它31个青菜自交系或品种在苗期的抗热性介于华王和小八叶之间。,侧枝不再抽薹,逆转入营养生长阶段。抗热品种华王主薹还能缓慢开花,但难以正常结实。而热敏感品种小八叶的花器官分化出现不正常。,因此本发明人在比较品种间抗热性的时候需要引入相对值的概念即热抗指数来扣除无高温胁迫存在时各品种的本底差异。本发明人分别考察了已知的抗热品种华王和不耐热品种小八叶在