低含量烟草环斑病毒外壳重组蛋白的原核表达的制备方法.docx

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专利名称:低含量烟草环斑病毒外壳重组蛋白的原核表达的制备方法
技术领域:
本发明涉及一种抗血清的制备方法,尤其涉及一种低含量烟草环斑病毒外壳重组蛋白的原核表达的制备方法。
背景技术:
烟草环斑病毒(Tobaccoringspotvirus,TRSV)为豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)成员,病毒粒子为等径二十面体,直径约28nm。基因组含两条线形正义ssRNA,RNA1编码复制酶,RNA2编码运动蛋白(MP)和外壳蛋白(CP)。分布于日本、澳大利亚、新西兰、丹麦、法国、德国、荷兰、英国、美国等30多个国家。该病毒寄主范围广,可侵染54科246种植物,是果树、蔬菜、花卉和经济作物的重要病害之一。引起多种植物病害,严重时导致绝产。
TRSV为我国进境检疫法规中明确规定的危险性有害生物,寄主范围广、适生性强,进口植物种子和苗木携带该病毒的风险性很大,伴随着我国进出境贸易的高速增长,传入我国定植并危害流行的可能性极大。
本试验以TRSV的提纯病毒为试验材料,通过分子生物学方法,克隆TRSV病毒的外壳蛋白部分基因,将其在原核细胞中诱导表达,得到纯化的重组蛋白,为制备特异性的抗血清奠定了基础。纯化的重组蛋白不含寄主植物成分,所制取的抗血清特异性强。对一些在寄主体内含量较低或较难提纯的病毒来讲,用传统的提纯病毒制备抗血清十分困难,而用纯化的重组
蛋白制备抗血清的方法就显得十分重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种在血清检测中提纯低浓度或较难提纯的病毒用作检测抗原的方法。
为解决上述技术问题,本发明提供一种低含量烟草环斑病毒外壳重组蛋白的原核表达的制备方法,它包含下列步骤a)将烟草环斑病毒毒源摩擦接种白肋烟,1-2周后,取除根外的带毒株进行病毒的提纯;b)根据烟草环斑病毒的5个分离物的CP基因的保守序列设计引物;c)从所述接种烟草环斑病毒的白肋烟叶片中提取RNA;d)RT-PCR扩增烟草环斑病毒的cDN***段;e)PCR电泳回收产物转化大肠杆菌感受态细胞,挑取克隆,碱法提取质粒进行酶切后电泳分析原PCR产物并进行测序鉴定;f)选择与预期大小相符的条带进行回收,通过双酶切得到目的基因片断,连接质粒,转化大肠杆菌感受态细胞,筛选得到重组质粒;g)将构建好的重组载体转化入大肠杆菌表达菌株内,挑取单克隆进行目的基因的小量表达;h)挑取单克隆进行目的基因的大量表达;i)将诱导前的样品、诱导后的样品和过柱后的样品分别进行纯化并进行SDS-PAGE
鉴定蛋白纯度;j)以烟草环斑病毒抗血清为一抗,碱性磷酸酯酶标记的A蛋白为二抗,用NBT-BCIP显色,Western-Blot鉴定所提纯的蛋白作为抗原进行血清学检测。
本发明由于提供了一种新的利用重组技术和原核表达技术对一些在寄主体内含量较低或较难提纯的病毒进行克隆,制备的方法取得该病毒的抗原,从而使得利用常规血清学检验方法检验出这些病毒抗原变为可能。
图1是本发明低含量烟草环斑病毒外壳重组蛋白的原核表达的制备方法的TRSV的RT-PCR扩增结果;图2是本发明低含量烟草环斑病毒外壳重组蛋白的原核表达的制备方法的酶切后测序结果比对结果;图3是本发明低含量烟草环斑病毒外壳重组蛋白的原核表达的制备方法的表达产物的Westernblot分析;图4是本发明低含量烟草环斑病毒外壳重组蛋白的原核表达的制备方法的表达产物的SDS-PAGE分析。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1TRSV的提纯将TRSV毒源摩擦接种白肋烟,1~2周时间后,取带毒全株(根除外)进行病毒的提纯。
选用TRSV接种的白肋烟1000g,(磷酸盐缓冲液)(,%巯基乙酸),全部置组织捣碎机里捣碎,尼龙纱过滤,滤液加入同等体积的***仿,悬浮搅拌15min后,9000r/min离心15min;上清液加质量浓度为
8%PEG(聚乙二醇)(分子量6000),4%NaCl(***化钠),置4℃冰箱悬浮搅拌4h,9000gr/min离心20min;,置4℃冰箱悬浮搅拌4h或过夜,9000r/min离心15min;将收集的上清液30000r/min离心3h;沉淀悬浮于去离子水中,9000gr/min离心20min,上清液即为病毒粗提液;将上述病毒粗提液经25%甘油垫超速离心,即得提纯病毒。
实施例2引物设计根据最新报道的TRSV5个分离物的CP基因(GeneBank登录号AF462263、AF461164、AY787756、NC-005096、L09205)的保守序列设计一对特异性引物TRSV-F5’-CGCGAATTCATGTGTGCTGTGACAGTTGTTCC-3’(下划线部分为EcoRI酶切位点)和TRSV-R5’-ATCCTCGAGTCCGCTTATAGTGCCAGACCA-3’(下划线部分为XhoI酶切位点)。
,加入1000mlTRIZOL(总RNA提取试剂),,加200μl***仿,振荡2min,4℃11000r/min离心10min。取上清加入500ml异丙醇,-20℃沉淀10min,4℃12000r/min离心15min,沉淀用75%的乙醇洗一次,4℃7500r/min离心5min,沉淀溶于3μlddH2O中,即为提取的RNA,-70℃保存备用。
实施例4RT-PCRcDNA第一链合成在20μL体系中进行,内含
3μL模板RNA、1μLAMV(一种反转录酶)(30U/μL)、1μLRNase(RNA酶)抑制剂(30U/μL)、1μL下游引物(20μmol/L)、2μLdNTP(脱氧核苷三磷酸)(10mmol/L)和5μL5×AMV缓冲液。42℃水浴60min后,分别取2μL合成好的cDNA用于PCR扩增。
PCR反应条件为94℃预变性4min后进行94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸2min的30个循环的扩增,72℃延伸10min后保存于4℃。
实施例5PCR产物的克隆和酶切鉴定PCR产物用1%的琼脂糖进行电泳,与预期大小相符的条带经DNA(脱氧核糖核酸)回收试剂盒回收后,进行T-A克隆,所用载体为pMD18-T(质粒名称)。并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,加入500ulLB(LB培养基),37℃,100rpm(每分钟转数)45min,取200ul涂布至Amp(氨苄青霉素)板(100ug/ml),37℃倒置培养过夜,至克隆长出。挑取白色菌落,碱法小量提取质粒,酶切后电泳分析插入片段的大小,并进行测序验证。
实施例6原核表达载体的构建与预期大小相符的条带经DNA回收试剂盒回收后以EcoRI和XhoI双酶切后得到744bp(碱基对)的目的基因片段,与经EcoRI和XhoI双酶切的质粒pET28a连接,并转化大肠杆菌DH5α,筛选得到重组质粒。
实施例7融合蛋白的小量表达将构建好的pET28a重组载体转化入大肠杆菌表达菌株BL21(为特定大肠杆菌名称)。挑取单克隆,加入
3mlKan抗性/LB液体培养基中,37℃、250rpm,培养过夜。取100μl菌液,加入5mlKan抗性/LB液体培养基中,37℃、250rpm,培养3hr,至OD(光密度值)。加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至菌液中,,30℃继续培养4小时。,沉淀备用。SDS-PAGE的浓度为12%,电泳鉴定表明,目的基因已经表达。再按照上述方法进行蛋白诱导表达10ml,然后收菌。将菌体用3mlPBS重悬,超生10min,功率为200瓦。10000g离心20分钟,分别回收上清和沉淀。
实施例8目的基因的大量表达挑取单克隆,加入20mlKan(卡那霉素)抗性/LB液体培养基中,37℃、250rpm,培养过夜。将20ml菌液,加入到1000mlKan抗性/LB液体培养基中,37℃、250rpm,培养3hr,。加IPTG至菌液中,,30℃继续培养4小时。10000g,4℃离心10min,弃上清,沉淀备用。
实施例9表达蛋白的纯化和SDS-PAGE鉴定蛋白纯度将诱导前的样品、诱导后的样品(包括上清和沉淀)和过柱后的样品各取20ul分别加入20ul2×蛋白loadingbuffer(上样缓冲液),将1次洗涤液分别取20ul并加入20ul2×蛋白loadingbuffer混匀,蛋白洗脱液各取10ul,加入10ul2×蛋白loadingbuffer混匀后,100℃煮5分钟,12000g离心15分钟,留取上清做SDS-PAGE。凝胶浓度为12%。
实施例10Western-Blot鉴定以TRSV抗血清(agdia公司)为一抗,碱性磷酸酯酶标记的A蛋白为二抗。最后用NBT/BCIP显色。分离包涵体,溶解后进行SDS-PAGE。按照Hager等的方法对凝胶染色后,从中切下目标条带,按1∶1的比例(W/V)%的生理盐水,于冰浴中研磨,12000g离心10分钟,%生理盐水透析过夜,-20℃保存。
实施例11TRSVCP基因的RT-PCR扩增及克隆用设计的TRSVCP基因特异性引物TRSV-F和TRSV-R进行RT-PCR,扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳,可见大小744bp的特异性扩增片段,与预期的大小相符,结果见图1。其中M为DNAMarker(标记)(TaKaRaD2000,1000,750,500,250,100bp);1,2为TRSV纯病毒;3为健康白肋烟;4为空白对照。
扩增产物经纯化后克隆到pMD18-T载体上。经蓝白斑筛选、酶切鉴定和序列测定,得到了含有目的基因片段的重组子pETCP1-744。
实施例12重组质粒的PCR验证和酶切验证对pETCP1-744用引物TRSV-F和TRSV-R进行扩增,得到一744bp的条带,利用GenBank(核苷酸序列的数据库)中Blast(比对)程序对测定的序列进行比对,同源性高达90%以上,结果证明测定序列为TRSV的部分序列;对pETCP1-744进行双酶切,可见一744bp条带,与预期大小相符,说明截短的TRSVCP基因(TRSVCP1-744)已连接到pET28a载体上。测序结果(见图
2)证明阅读框架正确。其中AF461163、AF461164、AY787756、NC-005096和L09205为Genbank公布的TRSV5个分离物的序列;TRSV-BIAODA为本实验酶切后测定的序列。
实施例13
表达产物的SDS-PAGE检测和Westernblot分析将重组质粒转化大肠杆菌BL21,并进行诱导表达,SDS-PAGE后,考马斯亮蓝染色结果表明经IPTG诱导,含重组质粒的菌株特异的产生了一条分子量为35kDa(千道尔顿)的条带。此条带大小与预期相符(图3)。其中M为蛋白Marker;1,2为纯化的蛋白。Westernblot显示,TRSV抗血清(agdia公司)仅与此35kDa的诱导表达产物反应,而与其它条带之间均无反应,表明所表达的目的基因产物即为截短的TRSVCP基因(TRSVCP1-744)产物。
实施例14表达产物的纯化及定量对诱导表达后的菌体反复冻溶,高速离心后,分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE,证明蛋白得到表达,但表达产物主要在沉淀中,即主要以包涵体形式存在。将分离的包涵体电泳后,对35kDa的条带切胶、研磨、离心、透析,得到纯度较高的表达产物(图4)。其中M为蛋白Marker;1为未诱导;2为超声上清;3为超声沉淀;4为上清沉淀混合;5为洗液;6~9为分别洗柱1~4次后的诱导产物。
实施例15表达产物的ELISA酶联免疫吸附试验选用美国
agdia公司生产的TRSV血清检测试剂盒,将表达的蛋白作为待检样品,设立阳性对照和阴性对照,结果表达的蛋白呈较强的阳性反应。
序列表<110>上海出入境检验检疫局、上海交通大学、中国人民解放军第二军医大学基础部<120>低含量烟草环斑病毒外壳重组蛋白的原核表达的制备方法<130>NP-10431<160>2<170><210>1<211>32<212>DNA<213>TobaccoRingspotVirus<400>1CGCGAATTCATGTGTGCTGTGACAGTTGTTCC32<210>2<211>30<212>DNA<213>TobaccoRingspotVirus<400>2ATCCTCGAGTCCGCTTATAGTGCCAGACCA30
权利要求
,其特征在于它包含下列步骤a)将烟草环斑病毒毒源摩擦接种白肋烟,1~2周后,取除根外的带毒株进行病毒的提纯;b)根据烟草环斑病毒的5个分离物的外壳蛋白CP基因的保守序列设计引物;
c)从所述接种烟草环斑病毒的白肋烟叶片中提取RNA;d)RT-PCR扩增烟草环斑病毒的cDN***段;e)PCR电泳回收产物转化大肠杆菌感受态细胞,挑取克隆,碱法提取质粒进行酶切后电泳分析原PCR产物并进行测序鉴定;f)选择与预期大小相符的条带进行回收,通过双酶切得到目的基因片断,连接质粒,转化大肠杆菌感受态细胞,筛选得到重组质粒;g)将构建好的重组载体转化入大肠杆菌表达菌株内,挑取单克隆进行目的基因的小量表达;h)挑取单克隆进行目的基因的大量表达;i)将诱导前的样品、诱导后的样品和过柱后的样品分别进行纯化并进行SDS-PAGE鉴定蛋白纯度;j)以烟草环斑病毒抗血清为一抗,碱性磷酸酯酶标记的A蛋白为二抗,用NBT-BCIP显色,Western-Blot鉴定所提纯的蛋白作为抗原进行血清学检测。
,。
,其特征在于所述RT-PCR的反应条件为94℃预变性4分钟后进行94℃变性30秒、55℃复性30秒、72℃延伸2分钟的30个循环的扩增,72℃延伸10分钟后保存于4℃。
,其特征在于所述大肠杆菌感受态细胞为