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低分泌蛋白酶a酿酒酵母菌株及其构建方法
本发明公开了一种可提高啤酒的泡沫稳定性的低蛋白酶A分泌的酿酒酵母菌株及其构建方法。本发明提供的低蛋白酶A分泌的酿酒酵母菌株通过敲除编码组成型分泌途径中的关键蛋白因子Sec5p的SEC5基因全序列来获得。所述低蛋白酶A分泌的酿酒酵母菌株,在氮源缺乏麦芽汁中以16℃发酵4-5d,发酵液中蛋白酶A的酶活与出发菌株明显降低,泡持性明显增加;同时发酵性能及生长性能良好,未出现影响重组菌株生长性能或温度致死的情况。对于模式菌株W303-1A还取得了预想不到的效果,其重组菌株的生长发酵性能非但没有下降,反而提高了发酵速度,从5天缩短到4天。
【专利说明】低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株及其构建方法
【技术领域】:
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】,特别涉及一种低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株及其构建方法。
【背景技术】:
[0002]纯生啤酒是指采用无菌酿造、无菌过滤、无菌包装生产的一种健康时尚、口感新鲜、自然、卫生、安全营养的鲜啤酒。由于在生产过程中没有经过巴氏杀菌或瞬间杀菌,避免了加热造成的风味物质和营养成分的破坏,保持了啤酒的新鲜口味和成分,因而与普通啤酒相比,纯生啤酒更纯正、更爽口、更新鲜、营养更丰富。
[0003]然而,纯生啤酒在泡沫质量方面存在着明显的质量缺陷,即随着货架时间的延长,泡沫稳定性逐渐下降。因此,提高纯生啤酒的泡沫稳定性一直是纯生啤酒生产厂家亟待解决的技术难题。国内外研究资料表明,蛋白酶A是导致纯生啤酒泡持性下降的主要原因。蛋白酶A()是在啤酒发酵过程中由酵母分泌的一种酸性蛋白酶。纯生啤酒因未经巴氏杀菌而残存蛋白酶A,随着货架时间的延长,蛋白酶A会分解啤酒内的泡沫活性蛋白而导致啤酒泡沫泡持性下降。
[0004]目前,国内外主要从添加蛋白酶A抑制剂、优化发酵工、菌种改造等方面入手来降低蛋白酶A,提高啤酒泡沫稳定性。添加蛋白酶A抑制剂虽可降低蛋白酶A的活性,但外源物质的加入可能会影响啤酒的风味、稳定性和安全性。从发酵工艺来看,为了维持啤酒的风味特征,啤酒发酵的原辅料处理、发酵温度、灌压等条件相对固定,通过调整这些条件来降低蛋白酶A分泌,提高啤酒泡沫稳定性的空间不大。通过敲除蛋白酶A基因的方法虽可降低蛋白酶A的分泌,但同时会影响酵母的生理生化特性。
[0005]常规条件下,蛋白酶A定位于酵母细胞液泡内,参与液泡内多种蛋白的成熟和激活过程。有研究表明,在氮源缺乏、CO2浓度过高或酒精度过高等胁迫条件下,蛋白酶
A可以分泌到胞外,并推测是可能是通过缺省途径(defaultpathway)来完成的。研究表明常规条件下,组成型分泌途径是细胞膜蛋白和分泌型蛋白的主要运输途径,但目前对于胁迫条件下组成型蛋白分泌途径的研究报道很少,尤其是对于蛋白酶A在胁迫条件下外分泌途径的研究更是空白。常规条件下,细胞内的组成型分泌途径是通过囊泡来介导完成的,包括四个步骤:囊泡的出芽、转运、栓系和融合。而胞吐复合体在囊泡的栓系和融合过程中发挥重要作用,由八个不同的亚基(Sec3p、Sec5p、Sec6p、Sec8p、SeclOp、Secl5p、Exo70p和Exo84p)组合而成,其中Sec5p是复合体的核心因子,维持着胞吐复合体的完整性和稳定性。有研究表明,将果蝇的SEC5基因敲除后会影响生殖细胞的生长及细胞中膜的极性运输,并使其对温度敏感;将酵母中的SEC5基因敲除会引起菌体对温度的异常敏感。
[0006]目前通过敲除酿酒酵母组成型分泌途径中的关键蛋白因子Sec5p来降低胁迫条件下蛋白酶A的分泌量的方法尚未见报道。本发明通过敲除酵母中组成型分泌途径中胞吐复合体的核心因子Sec5p的基因来选育适合啤酒发酵的低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株,从而提高啤酒的泡沫稳定性。
【发明内容】
:
[0007]本发明所解决上述技术问题所采用的技术方案是通过敲除酿酒酵母出发菌株中
编码组成型分泌途径中的关键蛋白因子Sec5p的SEC5基因全序列,获得低蛋白酶A酿酒酵母菌株。
[0008]所述SEC5基因其GeneID为:851744,核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示。
[0009]优选的,所述酿酒酵母出发菌株为模式菌株W303-1A;
[0010]优选的,所述酿酒酵母出发菌株为工业菌株S6。
[0011]所述低蛋白酶A分泌的酿酒酵母菌株的构建方法,包括如下步骤:
[0012](1)将含有SEC5基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX插入质粒中,得到重组质粒;
[0013](2)以重组质粒为模板扩增出含有SEC5基因的上、下游序列及标记基因KanMX的重组片段,将重组片段转化入酿酒酵母出发菌株中,得到重组后的基因工程菌株;
[0014](3)KanMX抗性基因的去除;
[0015](4)pGAPza质粒丢失
[0016]具体如下:
[0017](1)重组质粒的构建
[0018]①以出发菌株总DNA为模板,PCR扩增出SEC5基因的上、下游序列;
[0019]②以含有Amp抗性的穿梭质粒pUC6为模板,PCR
扩增出KanMX抗性基因;
[0020]③将步骤(1)-①和(1)-②获得的PCR产物依次连接到含有Amp抗性的pUC19质粒上,获得重组质粒;
[0021](2)SEC5基因的敲除
[0022]①以步骤⑴中的重组质粒为模板,扩增出含有SEC5基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX的重组片段;
[0023]②用醋酸锂转化法将(2)_①中的重组片段转化入出发菌株中,得到重组菌株;
[0024](3)KanMX抗性基因的去除
[0025]①利用醋酸锂转化法将pGAPza质粒转入步骤(2)-②中的重组菌株中,
[0026]②用Zeocin抗性平板筛选转化子,挑选在YEH)平板上生长而在G418平板上不生长的基因工程菌株;
[0027](4)pGAPza质粒丢失
[0028]将步骤(3)_②中挑选的基因工程菌株于YEH)液体培养基中进行传代培养,选取第一代及第十代以后各培养物提取酵母质粒并以此为模板,用引物进行PCR扩增,验证pGAPza质粒是否丢失。
[0029](5)工业菌株进行第二条等位基因敲除
[0030]利用(2)-②中所述方法向⑷中得到的菌株中导入(2)-①所得的重组片段,筛选得第二条等位基因缺失的重组工业菌株,并按照步骤(
3)和(4)去除KanMX抗性基因。
[0031]所述重组菌株可通过上述方法构建获得,这些方法已有许多文献报道,如Jos印hSambrook等,《分子克隆实验指南》第二版,科学出版社,1995。也可用本领域已知的其它方法来构建基因突变的酵母菌株。
[0032]本发明同时提供了一种专门用于鉴定所述低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株的基因序列,该基因序列是以所述低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株基因组为模板扩增的特异性片段,该特异性片段的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。
[0033]本发明所述酿酒酵母菌株在其他发酵性能不受影响的情况下,在氮源缺乏麦芽汁中以16°C发酵4-5d,发酵液中蛋白酶A的酶活与出发菌株明显降低,泡持性明显增加。
[0034]有益效果:
[0035]1、本发明选育的酿酒酵母菌株明显降低了蛋白酶A的胞外分泌量,能够提高纯生啤酒的泡持性,对于模式菌W303-1A,其重组菌株的蛋白酶A酶活较出发菌株有明显降低,降低约29%,同时,重组菌株的泡持性相较出发菌增加了17%;对于工业菌株S6其重组菌株的蛋白酶A酶活有明显降低,约为16%,同时,重组菌株的泡持性相较出发菌增加了13%。
[0036]2、本发明选育的酿酒酵母菌株在啤酒发酵的条件下,发酵性能及生长性能良好,未出现影响重组菌株生长性能或温度致死的情况。对于模式菌株W303-1A还取得了预想不到的效果,其重组菌株的生长发酵性能非但没有下降,反而提高了发酵速度,从5天缩短到4天。
[0037]3、本发明选育的低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株是通过敲除常规条件下组成型分泌途径中胞吐复合体的核心因子Sec5p的基因来实现的,这为胁迫条件下选育低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株提供了一个新的方向。
【专利附图】
【附图说明】:
[0038]图1为pUC-AKB质粒构建过程
[0039]图2为pUC-AKB重组质粒验证图
[0040]a中M为DNAmaker,泳道1为KpnI单酶切pUC-A质粒,泳道2为EcoRI和KpnI双酶切pUC-19质粒
[0041]b中M为DNAmaker,泳道1为BamHI单酶切pUC-AK质粒
[0042]c中M为DNAmaker;泳道1为以重组质粒pUC-AKB为模板,以SAl和SB2为引物PCR验证;泳道2为以质粒pUC19为模板,以SAl和SB2为引物PCR验证
[0043]图3为基因盒SA-KanMX-SB片段与酵母基因组同源重组过程
[0044]图4为重组菌株PCR验证结果
[0045]a中M为DL5000DNAmaker(从上至下依次为:5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250和IOObp);泳道1为以重组菌株WS5K为模板,以SlU和SlD为引物PCR验证;泳道2为重组菌株SS5K-1为模板,以SlU和SlD为引物PCR验证;泳道3为出发菌株W303-1A为模板,以SlU和SlD为引物PCR验证;泳道4为出发菌株S6为模板,以SlU和SlD为引物PCR验证
[0046]b中M为DL5000DNAmaker(从上至下依次为:5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250和IOObp);泳道1为重组菌株WS5K为模板,以S2U和S2D为引物PCR验证;泳道2为重组菌株SS5K-1为模板,以S2U和S2D为引物PCR验证;泳道3为出发菌株W303-1A为模板,以S2U和S2D为引物PCR验证;泳道4为出发菌株S6为模板,以S2U和S2D为引物PCR验证
[0047]图5为重组菌株WS5KKanMX抗性基因剔除及pGAPza质粒丢失验证
[0048]a中M为DNAMarker;泳道1为以重组菌株WS5K基因组为模板,Kl和K2为引物进行PCR扩增的产物;泳道2为以去除KanMX抗性基因的重组菌株基因组为模板,Kl和K2为引物进行PCR扩增;
[0049]b中M为DNAMarker;泳道1为以去除KanMX抗性基因重组
菌株的第一代酵母质粒为模板,Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物;泳道2为以去除KanMX抗性基因重组菌株的第十代酵母质粒为模板,Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物;
[0050]图6为重组菌株SS5K-lKanMX抗性基因剔除及pGAPza质粒丢失验证
[0051]a中M为DNAMarker;泳道1为为以去除KanMX抗性基因的重组菌株基因组为模板,Kl和K2为引物进行PCR扩增;泳道2为以重组菌株SS5K-1基因组为模板,Kl和K2为引物进行PCR扩增的产物;
[0052]b中M为DNAMarker;泳道1以去除KanMX抗性基因重组菌株的第十代酵母质粒为模板,Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物;泳道2为以去除KanMX抗性基因重组菌株的第一代酵母质粒为模板,Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物;
[0053]图7为敲除第二个等位基因的重组菌株PCR验证结果
[0054]a中M为DNAmaker;泳道1为以重组菌株SS5-1为模板,以SlU和SlD为引物PCR验证;泳道2为重组菌株SS5K-2为模板,以SlU和SlD为引物PCR验证;
[0055]b中M为DNAmaker;泳道1为以重组菌株SS5-1为模板,以S2U和S2D为引物PCR验证;泳道2为重组菌株
SS5K-2为模板,以S2U和S2D为引物PCR验证;
[0056]图8为重组菌株SS5K_2KanMX抗性基因剔除及pGAPza质粒丢失验证
[0057]a中M为DNAMarker;泳道1为以重组菌株SS5K-2基因组为模板,Kl和K2为引物进行PCR扩增的产物;泳道2为以去除KanMX抗性基因的重组菌株基因组为模板,Kl和K2为引物进行PCR扩增;;
[0058]b中M为DNAMarker;泳道1为以去除KanMX抗性基因重组菌株的第一代酵母质粒为模板,Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物;泳道2为以去除KanMX抗性基因重组菌株的第十代酵母质粒为模板,Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物;
[0059]图9为出发菌株W303-1A及重组菌株WS5二氧化碳累积失重
[0060]图10为出发菌株S6及重组菌株SS5-2二氧化碳累积失重
【具体实施方式】:
[0061]下面通过具体的实施方案叙述本发明的低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株及其构建方法。下述实施例中的方法,如无特别说明,均为常规方法。
[0062]实施例1:低分泌蛋白酶A酿酒酵母菌株WS5的构建