人t2r苦味受体及其用途的制作方法.docx

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专利名称:人t2r苦味受体及其用途的制作方法
相关申请
本申请要求2007年8月21日提交的美国临时申请序列号60/957,129和2008年4月23日提交的美国临时申请序列号61/047,187的权益,并且涉及美国申请序列号11/766,974,美国申请序列号11/766,974是2006年11月1日提交的美国申请序列号11/555,617的部分连续申请,而美国申请序列号11/555,617是2002年7月10日提交的美国申请序列号10/191,058的部分连续申请,并且还是2003年12月1日提交的美国申请序列号10/742,209的部分连续申请,美国申请序列号10/742,209是2001年4月5日提交的美国申请序列号09/825,882(现在是美国专利号7,105,650)的分案申请,全部这些申请通过引用它们的整体在此并入。
发明领域本申请涉及人2型味觉受体(hT2R)的鉴别及其在活化特异性T2R的配体的鉴别测定中的用途。这些配体用于调节味觉,特别是苦味。在我们先前的专利申请中,我们描述了人苦味受体,包括hT2R8和hT2R14的功能表达。在这一专利申请中,我们报道了hT2R8和hT2R14通过咖啡的苦味富集的级分活化,我们还报道了使用高通量筛选测定鉴别hT2R8和hT2R14的拮抗剂,且该拮抗剂的组合物可减少咖啡和咖啡级分的苦味。这一发明提供了修饰和改善咖啡饮品的味道的方法。
特别地,本发明涉及hT2R8和/或hT2T14在鉴别抑制(阻断)咖啡和其他食物和饮料的苦味的化合物的筛选测定和味觉测试中的用途。
另外,本发明涉及具有宽泛的苦味拮抗特性的配体的发现,即该配体明显地阻断或抑制不同组的苦味配体对许多(13)不同的苦味受体的活化,并阻断或抑制六种其他苦味受体的活化,以及抑制由一些苦味化合物引起的苦味,对所述化合物来说,与它们相互作用的苦味受体至今还没有被说明。
更加具体地,本发明涉及具有宽泛的苦味拮抗特性,本文中称为化合物C的配体的发现,即该配体明显地阻断或抑制由不同组的苦味配体对hT2R3、7、10、14、16、44、51、55、61、63、64、65和71苦味受体的活化,并阻断或抑制六种其他苦味受体,即hT2R5、9、13、54、67和75的活化,以及抑制由一些苦味化合物引起的苦味,对所述化合物来说,与它们相互作用的苦味受体至今还没有被说明。
更加具体地,本发明还提供了这一拮抗剂化合物减少水杨苷(hT2R16拮抗剂)和苯硫脲(hT2R51激动剂)的苦味的发现。
更加具体地,本发明还提供了以下发现,这一相同的拮抗剂化合物阻断由活化多种苦味受体的苦味化合物引起的苦味,所述苦味化合物包括活化hT2R10、14和75的奥美拉唑;莱鲍迪甙A(RebaudiosideA),一种活化至少7种苦味受体的天然增甜剂;并且这一相同的拮抗剂还进一步抑制由苦味化合物引起的苦味,其中与它们相互作用的苦味受体是未知的,苦味化合物包括右美沙芬和苯***。
根据以上,本发明涉及这一化合物在食物、饮料、药物和其他摄取物(ingestibles)中的用途,从而缓解其苦味,包括由未鉴别的苦味配体或化合物引起的苦味,其中苦味涉及多种苦味受体的活化,或对于苦味化合物,其中其受体特异性未被确定。
根据以上,本发明还涉及这一拮抗剂用于说明存在于不同的人T2R的保守基序的用途,所述基序涉及配体结合和T2R活化,以及嵌合和突变G蛋白偶联受体(GPCR)的设计,设计该G蛋白偶联受体以含有这一基序。
此外,本发明涉及使用这些筛选测定鉴别的化合物中的任何一个,以及其在食物饮料和药物中的用途,所述食物饮料和药物包括咖啡和咖啡味食物和饮料和药物。
相关领域描述人类可识别的基本味觉形式之一是苦味。直到最近,对苦味的生理学仍然知之甚少。最近的研究已经开始阐明味觉生物学(Lindemann,Nature(2001))。目前已知许多苦味化合物通过与细胞表面受体相互作用产生苦味。这些受体属于与胞内G蛋白相互作用的七跨膜结构域受体家族。已经在人和啮齿动物中鉴别了称为T2R的GPCR的新家族(Adler等人,Cell100(6)693-702(2000);Chandrashekar
等人,Cell100(6)703-711(2000);MatsunamiH,MontmayeurJP,(6778)601-4(2000))。本发明前的几项证据表明T2R介导对苦味化合物的响应。第一,T2R基因在舌和腭上皮细胞的味觉受体细胞的亚群中特异性表达。第二,人T2R之一(hT2R1)的基因位于与人对苦味化合物6-正丙基-2-硫尿嘧啶的敏感性有关的染色体位点(Adler等人,(Id.)(2000))。第三,小鼠的T2R之一(mT2R5)位于与小鼠对苦味化合物环己酰亚***的敏感性有关的染色体位点。还表明mT2R5可以活化味转导素,味转导素是特异性表达于味觉细胞并与苦味刺激转导有关的G蛋白(Wong等人,Nature381796-800(1996))。mT2R5对味转导素的活化仅出现于对环己酰亚***的响应(Chandrashekar等人,(Id.)(2000)。因此,已提议mT2R家族介导小鼠的苦味响应,而hT2R家族介导人的苦味响应。仅一种人T2R表明具有鉴别的苦味配体——hT2R4,显示被地那铵活化(Chandrashekar等人,(Id.)2000)。然而,该研究使用的有效地那铵的浓度()非同寻常地高,即比报道的人对地那铵的苦味阀值高105倍(Saroli,Naturwissenschaften71428-429(1984))。因此,没有特定的苦味配体有说服力地匹配于任何hT2R。还表明每种hT2R能够结合多种苦味配体。这一假设是基于hT2R家族仅由25个鉴别的成员组成,而人类可以识别数百种不同的苦味化合物的事实。先前已经报道了
hT2R的序列并且公开于Zuker等人(WO01/18050A2,(2001))和Adler等人(WO01/77676A1(2001))的公布的PCT申请,两者通过引用整体并入本文。
研究T2R功能的困难之一是这些受体在培养的哺乳动物细胞系中不容易表达。为了提高T2R的表达,将来自很好地表达的GPCR(视紫红质)的N末端序列连接到T2R序列(Chandrashekar等人,(Id.)2000)。由于有可用的抗体,这一N末端标签还允许容易地监测蛋白质的表达。此外,SSTR3标签(Bufe等人,-400(2002)),一种不同的N末端标签已经用于提高T2R的表达。尽管视紫红质标签的并入提高了一些T2R在哺乳动物细胞系中的表达,但是它们中的许多仍然没有被十分充分地表达以用于功能研究。在一个不同的方法中,mT2R5在昆虫Sf9细胞中成功地表达并且用于使用生物化学GTPγS结合测定的功能研究(Chandrashekar等人,(Id.)2000)。
在申请人以前的专利申请美国申请序列号09/825,882(现在为美国专利号7,105,650)中,申请人鉴别并提供了许多当时新型的人味觉受体包括hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R63、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71和hT2R75的核酸序列和多肽序列。此外在美国申请序列号11/182,942和10/628,464(其整体通过引用在此并入)中,申请人提供了另一种鉴别的新型人味觉受体(在其中称为hT2R76)的多肽和
DNA序列。
另外,在美国申请序列号10/191,058(其通过引用整体并入本文)中,申请人发现了特异性活化三种不同人T2R的配体。此外,申请人最近提交了美国申请序列号11/455,693(其整体通过引用在此并入),其进一步鉴别了特异性结合到其他人T2R的苦味配体并且提供了相关的测定。
另外,关于本发明的实际应用,已报道T2R和T1R味觉受体均在胃肠系统中表达。例如,Wu等人,Proc,,USA99(4)2392-7(2002)报道T2R与味转导素和转导蛋白的亚基在肠内分泌细胞(enterendocrinecell)(STC1细胞)中表达,并且这些细胞在胃肠道中可能响应苦味配体。另外,Chen等人,(4)C726-39(2006)报道苦味刺激在肠内分泌STC-1细胞中诱导Ca++信号和缩胆囊素(CCK)释放。另外,Rozengurt,AJPhysiolGastrointesLiverPhysiol291(2)G171-7(2006)报道肠中的味觉受体可能在感受(sensing)消化功能和激素和/或神经途径控制的分子中起作用,并且它们可以在有害药物和生存响应的检测中起作用。此外,(2)G457-61(2007)报道肠中的味觉受体可参与胃肠功能,例如分子感受、营养吸收、防御有害物质,并且进一步表明这些机理的理解可以与疾病的状态和情况(例如喂食障碍
(feedingdisorders))以及炎症有关。此外,Mace等人,(Epub)最近表明T2R和T1R活化磷脂酶Cβ2(PLCβ2),并且在肠中可能有与存在于舌细胞中的分子感受系统相似的分子肠感受系统,并且表达味觉受体的胃肠细胞,例如刷细胞或孤立化学感受细胞(solitarychemosensorycells)可引起GLUT2的增加并在营养感受,以及肥胖症和糖尿病治疗的营养学中起作用。另外,Cui等人,(35)4591-600(2006)表明在肠中表达的T1R可用于对治疗肥胖症和糖尿病中的化合物以及人工增甜剂的测定。
然而,尽管已经报道并且了解T2R成员调节苦味和它们在胃肠功能中的可能作用,但是仍然存在鉴别活化人苦味T2R味觉受体的特定的配体的需要。更深入地了解不同T2R特别是人T2R的结合特性将十分有益,原因是这将更有力地促进其在选择具有预期味觉调节特性(即阻断或抑制特定的苦味化合物的味道)的化合物中的应用。另外,将提供用于治疗和调节胃肠功能和相关疾病例如肥胖症、糖尿病、食物吸收(foodabsorption)、食物感受、进食障碍以及调控诸如GLUT2、缩胆囊素(cholecystokin)等的相关激素和肽的化合物的鉴别。
发明概述综上,本发明涉及hT2R8和hT2R14通过咖啡的苦味富集的级分活化的发现。
另外,本发明涉及其用于鉴别抑制或阻断咖啡和咖啡相关的食物、饮料和药物的苦味的hT2R8和hT2R14的拮抗剂的用途。
此外,本发明涉及抑制咖啡和其他咖啡味的食物、饮料和药物的苦味的具体拮抗剂(苦味阻断剂)化合物。
另外,本发明涉及具有宽泛的苦味拮抗特性的配体的发现,即该配体明显地阻断或抑制不同组的苦味配体对许多(13)不同的苦味受体的活化,并阻断或抑制六种其他苦味受体的活化,以及抑制由一些苦味化合物引起的苦味,对所述化合物来说,与它们相互作用的苦味受体至今还没有被说明。
更加具体地,本发明涉及具有宽泛的苦味拮抗特性,本文中称为化合物C的配体的发现,即该配体明显地阻断或抑制由不同组的苦味配体对hT2R3、7、10、14、16、44、51、55、61、63、64、65和71苦味受体的活化,并阻断或抑制六种其他苦味受体,即hT2R5、9、13、54、67和75的活化,以及抑制由一些苦味化合物引起的苦味,对所述化合物来说,与它们相互作用的苦味受体至今还没有被说明。
更加具体地,本发明还提供了这一拮抗剂化合物减少水杨苷(hT2R16拮抗剂)和苯硫脲(hT2R51激动剂)的苦味的发现。
更加具体地,本发明还提供了以下发现,这一相同的拮抗剂化合物阻断由活化多种苦味受体的苦味化合物引起的苦味,所述苦味化合物包括活化hT2R10、14和75的化合物奥美拉唑;莱鲍迪甙
A(RebaudiosideA),一种活化至少7种苦味受体的天然增甜剂;并且这一相同的拮抗剂化合物还进一步抑制由苦味化合物引起的苦味,其中与它们相互作用的苦味受体是未知的,苦味化合物包括右美沙芬和苯***。
根据以上,本发明涉及根据本发明的这一和相关化合物在食物、饮料、药物和其他摄取物中的用途,从而缓解其苦味,包括由未鉴别的苦味配体或化合物(其中苦味涉及多种苦味受体的活化)或苦味化合物(其中其受体特异性未被确定)引起的苦味。
另外,本发明涉及含有足以抑制或阻断食物、饮料和药物的苦味的量的鉴别的苦味拮抗剂化合物中的至少一种的所述食物、饮料和药物。
使用基于细胞的测定进行发明性发现,所述测定使用在存在和缺少特异性苦味配体时表达特定T2R的细胞测量T2R的活性。特别地,如以下更加详细地描述,HEK细胞系在它们的表面上表达以上鉴别的特异性T2R,并且进一步表达功能地偶联于所述T2R的嵌合G蛋白,所述细胞系用于检测细胞内钙浓度的变化的基于细胞的测定,且被发现由特定苦味化合物特异性活化,而在相似条件下,其他hT2R未被活化。
因此,本发明包括这些人味觉受体在测定,优选高通量测定中鉴别其他化合物的用途,所述其他化合物调节,优选阻断由存在于咖啡和相关食物和饮料中的这些和其他苦味化合物对这些受体的活化。
另外,本发明涉及这些受体鉴别引起苦味的化合物,特别是存在于咖啡和咖啡味的食物、饮料和药物中的那些化合物的用途。
另外,本发明涉及拥有宽泛范围的拮抗剂性质的拮抗剂化合物用于鉴别苦味化合物或苦味级分的体外测定和体内味觉测试的用途,对苦味化合物或苦味级分而言,该拮抗剂化合物抑制由苦味化合物或苦味级分引起的苦味,和/或抑制苦味化合物或含有这一苦味化合物的级分对一种或多种苦味受体的活化。
此外,本发明特别涉及这一宽泛作用的拮抗剂在食物、饮料、药物和人或动物摄取的其他消费品中的用途,其中苦味被明显地缓解。
本发明还涵盖包括一个额外步骤的测定,所述额外步骤评价鉴别的调节化合物在人或其他味觉测试中的效应,且特别评价鉴别的化合物对苦味的效应,特别是对由咖啡和衍生自咖啡的含有一种或多种引起苦味感觉的化合物的级分引起的苦味的效应。
此外,本发明包括已经被处理以除去特异性活化这些苦味受体的化合物的咖啡和咖啡味食物、饮料和药物的生产,例如已经被处理以除去或减少其中包含的苦味化合物的量的食物和饮料的生产。