多糖的分子量与分子量分布测定.doc

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多糖的分子量与分子量分布测定标准操作规程
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建立多糖的分子量与分子量分布测定的标准操作规程。
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《中华人民共和国药典》2000年版二部。
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适用于药品中多糖的分子量与分子量分布的测定。
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QC检验员对本标准的实施负责。
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色谱柱为测多糖专用凝胶柱(按所测样品的分子量大小选择特定排阻范围的凝胶柱)。检测器为示差折光检测器。
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按各品种项下要求对仪器进行适用性试验,规定分析状态下色谱柱的最小理论板数(n)和供试品在该分析状态下的分配系数(K)应达到规定的要求。d
—ttR0K=dt—tT0
式中t为供试品峰的保留时间;R
t为完全被填料颗粒网孔排阻的大分子的保留时间,一般指蓝色葡聚糖的保0
留时间。
t为能自由进出填料颗粒网孔的小分子的保留时间,一般指葡萄糖的保留时间。T
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:根据供试品分子量大小,一般选用5个已知分子量的多糖标准品(常用的为葡聚糖)分别用流动相制成每1ml中约含10mg的标准溶液,分别取上述标准溶液25μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。由GPC专用软件绘制标准曲线,得线性回归方程:
1gM=a+btWR
式中M为标样的已知重均分子量;W
t为标样的保留时间。R
:取供试品溶液25µl注入液相色谱仪,记录色谱图,按下式计算
分子量:
M=ΣRI/Σ(RI/M)niii
M=Σ(RIM)/ΣRIwiii
D=M/Mwn
式中M为数均分子量;n
RI为为样品i级分的物质量,即供试品在保留时间i的峰高;i
M为样品i级分的分子量,即供试品在保留时间i的分子量。i
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采用GPC专用软件,可获得供试品归一化色谱图,微分、积分分子量分布图,各时间点的分子量(片段数据)和各种平均分子量。根据供试品需要选择各项测定结果。