基片、制备和用途的制作方法.docx

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专利名称:基片、制备和用途的制作方法
技术领域:
本发明涉及活性基片的改善,所述活性基片可用来形成结合了探针、用于多反应体系的官能化基片,它们例如与靶分子相互作用。本发明的各个方面涉及化学修饰基片表面而在其上共价结合分子(例如,分子探针)的方法;从所述方法获得的和/或可获得的基片;应用所述基片制备多反应体系的进一步方法;通过所述方法获得的或可获得的多反应体系;所述多反应体系在分析和/或合成中的应用;应用所述多反应体系直接和/或间接合成的产品;和/或得自所述多反应体系的信息的应用。
在本文的实施方案中,所述多反应体系可能是显微阵列(例如,DNA显微阵列-也称为生物芯片);所述探针可能是DNA序列和/或寡核苷酸,而这样获得的信息可能是(生物)化学的和/或生物的信息。本发明的多反应体系的其它用途包括高处理量筛选。
一种显微阵列是多反应体系的一个实例,它是一种强有效的工具,能利用微量的样品和试剂平行操作数千个检测和分析试验。当例如为了筛选和/或分析和/或了解复杂的过程而需要操作很多试验时,这样的大规模平行技术吸引了科学家。
一个这样的用途是,DNA序列鉴定和基因表达的领域。在可获得
DNA芯片以前,基于聚合酶链反应(PCR)的经典技术只能一次检测或研究一个基因的表达。下列文献中描述了这样的技术“L’AvenirdelaPCRDiversificationdeTechnologiesetdesApplications”,LeTechnoscopeduBiofutur,171,~9(1997),将它的公开内容并入本文作参考。相比之下,DNA芯片能一次性分析高达几十万个基因。
应懂得,本文使用术语例如“多反应体系”、“显微阵列”、“芯片”和/或“生物芯片”来表示具有相同或相似的结构和/或基本原理的系统和/或装置,它们在本文可互换使用。生物芯片表示为了与生物活性分子一起使用的芯片。DNA显微阵列、DNA生物芯片和DNA芯片都表示这样的芯片,即,其上的探针都基于DNA序列或寡核苷酸。本文的大多数实例涉及DNA芯片,所以可省去词头DNA。
使多反应体系(例如,显微阵列)成为可能的基本原理是,任选以其上一定的方式选择性地和持久地将各种化学物质(例如,探针分子)结合在一个或一系列基片表面的能力。这类基片可用于这样的用途,即,结合的物质可进一步与它们的环境相互作用而牢固地连接在基片上。这些基片还可用于检测和/或分析(用合适的设备)对于结合到所述基片(和/或基片系列)上的整个系列物质有意义的给定性能。
通过DNA-生物芯片应用的杂交方法更详细地阐明了这一点。在该方法中,当两个彼此存在下,单链
DN***段优选结合在它的互补序列上。实际DNA生物芯片包括一个被有序排列的达数十万单链DNA序列(也称为捕获探针)覆盖的表面,它可以是寡核苷酸、cDNA或DN***段。然后该芯片暴露于未知的悬浮液中,但标记的DNA序列也称为靶。标记的靶将结合到捕获探针中它们的互补序列(如果它存在于芯片上)。所以,小心清洗后,将只在来自靶样品的片段已发现它的互补捕获探针的位置上发现标记。由于可从它的位置检测每个捕获探针的序列(因而检测它的互补靶的序列),所以有可能收集关于靶样品的基因含量的信息。
基于前述原理的DNA芯片可被设计成服务于很多不同的用途。例如,有可能测定当个体暴露于给定的物质中时,基因表达是如何变化的。这样的试验在药物工业中对于测定新药物的潜在副作用有意义。DNA芯片还可作为诊断装置,例如,测定引起感染的确切细菌株,于是给予患者最合适的抗生素。为这种用途设计的DNA芯片应证明比现在通用的任何测试迅速得多和更具专一性。DNA显微阵列还可在遗传病领域(其中,复杂的基因模式有时只被一个单一碱基对分化)中提供帮助。在更基本的研究用途中,对于基因测序的工作和在其它生物领域中进一步理解控制细胞寿命的复杂过程来说,显微阵列将继续是很好的工具。
杂交只是一种可在分子之间发生的相互作用,所以,操作千万个平行试验的构思可适用于其它领域。例如,虽然
DNA芯片可了解接触某些物质的细胞中发生了什么,但从研究基因表达不能获得某些信息。例如,在mRNA或者甚至蛋白质水平出现的因子使间题复杂化。因而,用来鉴定的蛋白质芯片和在蛋白质水平直接的剂量变化也应当是有意义的。
其它类的探针(它们应用非生物分子)也有意义。例如,要用于高处理量筛选,显微阵列可被选定的活性化学物质覆盖,就可以研究这些物质的各种性能和/或与一个样品的各种化学和物理相互作用。
目前有两类不同的方法来生产特别适用作DNA芯片的显微阵列芯片,两类方法都有缺点。
制造DNA芯片的第一类方法之一是Affymetrix开发的,它基于将构成该阵列的全部分子的就地逐步合成(例如,逐个碱基地合成寡核苷酸)。应用的技术借助于半导体生产工业,应用光刻法选择性地活化每一个位置(取决于接触显微阵列的下一个碱基是否适合该位置)。这类技术只允许有限尺寸的探针用于寡核苷酸和/或长于约20个碱基对的DNA,在制备的每一步引起的组合误差会使得难以达到可靠的产品。此外,该技术麻烦,费时,难于在正规实验室装置中重复,极昂贵和/或固定不变的。
此外,对于显微阵列的非DNA用途来说,光刻法特别不合适,因为通常需要光保护基来保护常用的化学试剂和/或探针上不耐光的基
(它们可能包括单体)。在有机化学工艺中,制备多组光保护的结构单元会是不切实际的。
制备显微阵列的第二种方法是近期得到普及的所谓的送递法。在送递法中,将探针或DN***段直接接枝到基片上。首先将它们悬浮于合适的载体介质中,通过任意合适的技术将它以微小的液滴淀积在基片上所要求的位置。典型的液滴体积是毫微升(1×10-9l)或者甚至皮升(1×10-12l)的体积。淀积这些液滴的适当方法包括,直接接触(例如,显微点样)和/或喷墨印刷。但是,虽然淀积微小的液滴可能是有利的,而实现功能显微阵列重要的是,制备的基片应保证DNA探针将在微小的液滴蒸发所需的时间内在那里反应(优选通过形成共价键)。在MarcSchena通过EatonPublishing(Natick,MA,USA)出版的“显微阵列生物芯片技术”(Micro-arrayBiochipTechnology),2000中详细描述了该送递方法;所以将该文献的内容并入作参考。
不论用于制备显微阵列的方法如何,要适当地起作用,重要的是显微阵列上的探针足够牢固地连接在显微阵列基片上。固定化探针不允许在不同的处理步骤(例如,与DNA生物芯片一起应用的杂交、洗涤和/或分析步骤)期间解吸。为了满足这些要求,基片与探针之间的共价键是优选的连接方式。牢固地连接了探针的显微阵列是有利的,因为此时探针更容易接受进一步的处理步骤(例如,DNA杂交),从而改善显微阵列的灵敏度。
为此,人们进行了很多尝试,试图将探针共价结合到显微阵列的基片上。例如,(分析生物化学(AnalyticalBiochemistry),280,~15,2000)比较了用于具体的玻璃基片情况的现有技术。研究的体系包括,连接在***化玻璃上的磷酸化DNA;连接在羧化玻璃上的***化DNA;以及连接在醛官能玻璃上的***化DNA。作者们总结出,通过偶联产率和不存在偶联剂时的反应速率测得,将***化DNA固定在醛改性的表面是构筑DNA显微阵列最好的偶联方法。
然而,醛官能基片与***化探针的反应虽然有效,但具有这一缺点,即,需要额外的还原步骤来稳定形成的碳-氮键。虽然醛基和氨基之间的初始反应生成亚氨基(包含C=N双键),它使探针牢固地连接到表面,但该反应在显微阵列应用时经历的很多条件下是可逆的。因此,在进一步的步骤中必须将亚氨基还原成氨基(包括更有耐性的C-N单键)从而将探针以共价键更不可逆地连接在基片上。又一个问题是,典型的醛官能团在长期贮存和应用的基片上不够稳定。所以,醛官能化基片需要多个处理步骤,而且在稳定性与接枝探针和提供抗性基片所需的反应性之间不具有最恰当的平衡。仍需要改良的结合体系。
现有显微阵列还存在很多其它问题。难于获得具有提高的功能和
/或活性位点密度和/或接枝密度的显微阵列。还希望显微阵列应当每单位面积具有尽可能多的探针而改善显微阵列的灵敏度。还重要的是,基片上的活性位点和/或官能度以可重现的和适应性强的方式获得。
不想受任何机理的限制,我们认为,解决上述一些或全部问题的的方法可能是,提供一种官能化基片,它能与同它接触的探针足够迅速地发生化学反应,于是,在其中应用探针的载体介质有时间干燥以前足够迅速地在探针与基片之间形成一种键(优选是共价键)。在载体介质的微小液滴中将探针应用于表面时,该问题是一个特殊的问题,因为这些液滴很迅速地干燥。在基片应用期间经历的条件下,合适的基片应当与探针以基本上不可逆的方式反应。
可任选通过本发明解决的又一个问题是提供在探针(例如,现今应用的典型DNA探针)的化学和基片的化学之间的正确结合,于是有可能将它们二者官能化。本发明解决的另一个任选的问题是提供官能化和/或活性基片,它在正常贮存条件下,在初步处理步骤中和/或在探针结合前的环境中都保持稳定。所以,不容易发现这种基片,它在对探针的高活性与贮存和应用期间的稳定性之间具有合适的平衡。因此,本发明另一个任选的目的是,提供具有基片的显微阵列,所述基片的一个表面可通过共价键牢固地结合探针,而且它在连接探针之前和以后两种情况下、在贮存和应用的条件下是稳定的。如果通过已知方法生产这样的基片,对于可应用的基片材料有严格限制,因为不是所有的方法都与所有的基片匹配。目前应用的大多数显微阵列是由玻璃基片制造的。虽然玻璃具有很多有利的性能,但它也具有缺点,例如,玻璃不容易以任何要求的形状生产。需要比玻璃具有更宽性能范围的基片来开发例如集成化芯片基实验
(lab-on-a-chip)和/或用于显微流体技术。聚合物是这类用途的优选基片,因为它们容易被加工成任何所需的形状(例如,通过模制)。因此,任选还希望提供一种适用非玻璃基片的方法,因为这将获得改善的显微阵列。所以,本发明另一个任选的目的是,提供具有本文所述的关于聚合物基片的一些或全部优点的显微阵列。
本发明又一个任选的目的是提供这样的显微阵列,其中,连接的(任选DNA)探针的密度(即,接枝密度)很高。本发明还有一个任选的目的是提供这类基片,即,具有提高的接枝密度(它是以可再现的方式获得的),而且可轻易按用户需要来修饰。官能化和/或活性基片还可用于显微流体系统,于是,本发明又一个任选的目的是,提供适合这样的系统的基片。
因此,本发明最宽范围的一个目的是,解决与现有技术显微阵列有关的前述的一些或全部问题。
所以,按本发明,提供了一种制备在其上具有对分子探针活性基呈活性的位点的基片的方法,该方法包括如下步骤,对所述基片表面施用一种物质,该物质包含一个或多个式
I的具有活化乙烯基不饱和双键的活性位点式I其中,如果n=0,m=1,X3是碳且X1是氮,它们之间的键就是三键,而且R4不存在;如果n=1,m=1,X3是碳且X1是氧或硫,它们之间的键就是双键,而且X2是被一个有机取代基取代的氧或硫或氮;如果n=1,m=1或2,X3是硫且X1是氧,它们之间的键就是双键,而且X2是被一个有机取代基取代的氮;R1,R2,各自独立表示氢,羟基或有机基,R3和R4各自独立表示氢或有机基,最后含一个硅原子,R1和R2不与R4连接。
随后,在进一步中,将分子探针的活性基与具有式I的活性位点的活化乙烯基不饱和双键共价结合。
按本发明,位于基片上的活性位点和分子探针之间的连接反应具有下列特征的至少一个(i)连接反应足够快,于是反应在应用的操作条件下基本上完全;(ii)该反应在一个步骤中在物质和基片之间形成牢固的结合键;和/或(iii)物质和基片之间的连接在基片的应用条件下基本上不可逆。
用于本文的“活性基片”表示一种基片,它具有位于它表面的、有效浓度的式I游离活性位点。
任选地,所述基片适用于多反应体系,例如,显微阵列。
本文应用的分子探针表示例如生物分子这样的探针,例如,DNA、RNA、蛋白质、生物素、***、除草剂、杀虫剂、碳水化合物、药物靶、抗生素、细胞毒物、类固醇、肽、核苷酸、肽核酸、结合配偶体、半抗原等。在本发明一个实施方案中,在多反应体系中应用的最终探针可能包含一种或多种不同的其它物质,它们以顺序方式
(例如,在链中)与结合到基片活性位点上的第一种探针连接。这样,具有任何所需性能的探针即使不适合(和/或不能被修饰而适合)直接连接到基片上的活性位点上,也可以使用。
任选地,所述载体介质是一种流体,例如,一种可在其中分散分子探针的液体。
优选地,所述流体和/或物质呈液滴形式应用,更优选通过直接方法,例如,显微点样和/或喷墨印刷(例如,感热式和/或压电式(piezo)喷墨印刷,例如,压电),例如采用的平均液滴体积为一毫微升或更小。
任选地,所述连接反应以足够迅速的方式发生,所以,在载体流体从其中蒸发以前(例如,当该载体流体作为液滴应用时),反应基本上完全。
本文应用的术语“牢固地连接的”表示,在显微阵列和/或基片将被应用的条件下(以及与其它试剂一起)基本上抗脱除。优选地,这说明通过一个共价键将分子探针连接到活性位点上;更优选每个活性位点借助于平均至少一个共价键与探针连接。更优选的是,这样形成的键在显微阵列的应用条件下基本上是不可逆的和/或是通过基本上不可逆的反应形成的。优选的共价键是碳-碳键和/或碳-氮键,而且更优选是饱和键,例如,