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基因重组人胸腺素β4的制备方法.docx


文档分类:医学/心理学 | 页数:约22页 举报非法文档有奖
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专利名称:基因重组人胸腺素β4的制备方法
技术领域:
本发明属于生物工程领域,具体涉及ー种用毕赤酵母表达的基因重组人胸腺素β4的制备方法。
背景技术:
胸腺素(Thymosins)是由胸腺产生的一种淋巴生长因子,由Goldstein和White于1966年首次从胎牛胸腺蛋白提取液中发现,是ー组小分子多肽,含有40多种组分。根据这些多肽在等电聚焦电泳分析图谱上的位置,可以划分为α、β、Y三型PI(α)7。目前已经有20多种β胸腺肽异构体被鉴定出来,而人体内主要存在三种胸腺素β4、胸腺素β10和胸腺素β15,其中胸腺素β4含量最高。胸腺素β4是由43个氨基酸组成,结构高度保守的水溶性多肽,N末端具有こ酰化修饰,平均分子量为4964Da,。胸腺素β4被认为是主要的球形肌动蛋白结合肽,能与球形肌动蛋白単体结合从而阻断其聚合,具有免疫调节的功能,是ー种在多种组织均有表达的蛋白多肽,在液体,血液中均存在。大量的研究表明胸腺素β4能够诱导内皮细胞分化,促进血管生成,井能促进创伤愈合和心肌梗塞时心肌细胞的存活和血管生成。胸腺素β4在治疗皮肤、角膜创伤,治疗心肌梗塞,抗肿瘤治疗,抗炎等方面有着广阔的应用前景,目前胸腺素
β4在治疗创伤、心肌梗塞等方面已经进入临床试验。目前临床和研究中使用的胸腺素β4的来源主要有两种,一是从小牛胸腺提取,ニ是化学合成。从小牛胸腺中提取胸腺素β4不仅成本高,且受材料来源和提取技术的限制,其纯度不高,含量较低;而杂质多也带来许多问题,尤其是目前牛的病毒越来越多,给动物提取也带来麻烦。随着基因工程的发展,利用基因工程手段来生产胸腺素β4将成为一个新的方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述胸腺素β4生产成本高、纯度底的缺点,提供ー种所得产品纯度高、生产成本低、简单有效的基因重组人胸腺素β4的制备方法。解决上述技术问题所采用的技术方案是以I型人胶原蛋白作为前导肽引导人胸腺素β4表达的基因重组人胸腺素β4融合蛋白,I型人!]父原蛋白的氣基酸序列为IGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPA61GQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQ121GPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVP⑶LGAPGPSGARGER181GFPGERGVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLP241GPKGDRGDAGPKGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAP301⑶RGEPGPPG
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PAGPQGPRGDKGET601EFDDDDKSDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES基因重组人胸腺素β4融合蛋白的氮端为I型人胶原蛋白的600个氨基酸组成的前导肽,碳端为人胸腺素β4的43个氨基酸,两段氨基酸序列之间添加肠激酶切割位点、用于连接的谷氨酸和苯丙氨酸,分泌表达后,在体外经肠激酶切割获得基因重组人胸腺素β4。基因重组人胸腺素β4的氨基酸序列如下ISDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES上述基因重组人胸腺素β4的制备方法包括下述步骤I、基因的获得从离体新生儿胎盘组织中提取总RNA,反转录获得cDNA,设计I型人胶原蛋白基因PCR扩增引物,,I型人胶原蛋白基因PCR扩增引物的序列为F:CGCTCGAGGGTGTTGCTGGTCCCAAGGGTR:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG采用PCR方法扩增获得I型人胶原蛋白基因,I型人胶原蛋白基因的核苷酸序列为ICTCGAGGGTGTTGCTGGTCCCAAGGGTCCCGCTGGTGAACGTGGTTCTCCTGGCCCTGCT61GGCCCCAAAGGATCTCCTGGTGAAGCTGGTCGTCCCGGTGAAGCTGGTCTGCCTGGTGCC121AAGGGTCTGACTGGAAGCCCTGGCAGCCCTGGTCCTGATGGCAAAACTGGCCCCCCTGGT181CCCGCCGGTCAAGATGGTCGCCCCGGACCCCCAGGCCCACCTGGTGCCCGTGGTCAGGCT241GGTGTGATGG
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IGAATTCGATGACGATGACAAGTCTGACAAACCCGATATGGCTGAGATTGAGAAGTTCGAT61AAGTCTAAGTTGAAGAAGACTGAGACTCAAGAGAAGAATCCATTGCCTTCCAAGGAGACC121ATTGAGCAGGAGAAGCAGGCCGGTGAATCTTAAGCGGCCGC2、载体pPIC9K与I型人胶原蛋白、人胸腺素β4的连接对pPIC9K、I型人胶原蛋白进行XhoI和EcoRI双酶切,回收酶切产物,用DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌,提取质粒,命名为PPIC9K-C0L1;对pPIC9K-C0Ll质粒与人胸腺素β4分别进行EcoRI、NotI双酶切,回收酶切产物,用DNA连接酶连接,转化大肠杆菌,提取质粒,命名为pPIC9K-COLl-T04;该重组DNA序列如下ICTCGAGGGTGTTGCTGGTCCCAAGGGTCCCGCTGGTGAACGTGGTTCTCCTGGCCCTGCT61GGCCCCAAAGGATCTCCTGGTGAAGCTGGTCGTCCCGGTGAAGCTGGTCTGCCTGGTGCC121AAGGGTCTGACTGGAAGCCCTGGCAGCCCTGGTCCTGATGGCAAAACTGGCCCCCCTGGT181CCCGCCGGTCAAGATGGTCGCCCCGGACCCCCAGGCCCACCTGGTGCCCGTGGTCAGGCT241GGTGTGATGGGATTCCCTGGACCTAAAGGTGCTGCTGGAGAGCCCGGCAAGGCTGGAGAG301CGAGGTGTTCCCGGACCCCCTGGCGCTGTCGGTCCTGCTGGCAAAGATGGAGAGGCTGGA
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、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上,30°C培养,筛选获得转化子,G418购于西安依科生物技术有限公司。5、基因重组人胸腺素β4融合蛋白毕赤酵母发酵将筛选到的转化子接种于400mlBMGY培养基中,30°C振荡培养24小时,作为ー级种子转接于装有4LFBS培养基的5L发酵罐中,300C、,作为ニ级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵,生长温度30°C、诱导温度29°C、、溶氧控制在20%30%,流加入质量浓度为75%的含12mL/LPTMl微量元素的甲醇水溶液,FBS培养基与质量浓度为75%的含12mL/,诱导发酵3642小时。6、基因重组人胸腺素β4的纯化发酵结束后,发酵液离心分离,取上清液,,收集滤过液,用分子量为10000D的卷式超滤膜超滤,收集浓缩液,得融合蛋白;用肠激酶切割法对融合蛋白进行切割,用分子量为10000D或30000D或40000D的超滤膜超滤,收集滤过液,再用分子量为1000D的超滤膜超滤除盐,得人胸腺素β4粗蛋白;对人胸腺素β4粗蛋白用装有DEAES印haroseFF填料的层析柱进行层析分离,得基因重组人胸腺素β40在本发明的基因重组人胸腺素β4的纯化步骤6中,发酵结束后,发酵液离心

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