基因捕获系统的制作方法.docx

该【基因捕获系统的制作方法 】是由【421989820】上传分享，文档一共【17】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【基因捕获系统的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。基因捕获系统的制作方法
专利名称:基因捕获系统的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种搜索在一定条件下表达的基因的方法,更具体地,本发明涉及一种基因捕获系统(gene-trapsystem),其将一个基因在一定条件下的瞬时表达固定为报道基因的组成型表达。
现有技术通过人基因组计划已经明确产生了大多数染色体DNA序列。然而,需要全面地搜索与生理学功能直接相关的功能基因,以在药物发现和安全性测试领域揭示新的方面。
作为全面捕获特异细胞类型内的转录的基因和功能基因(表达的基因)的方法,已经报道了三种方法如增强子捕获、启动子捕获和外显子捕获。然而,由于现有方法中的捕获载体自身伴随有报道基因功能(基因捕获的一种指征功能),因此可以捕获组成型和稳定表达的基因,但不能捕获在细胞改变如分化和恶性转化过程中瞬时表达的基因(;392(6676)608-11)。
本发明解决的问题本发明的目的是提供一种基因捕获系统(基因捕获的方法),其可以捕获任何基因,包括在细胞改变如分化和恶性转化过程中瞬时表达的基因。
解决问题的手段本发明的方法包括通过捕获载体捕获基因,其应用来自噬菌体P1的Cre重组酶,并将捕获基因的表达转变为添加的报道基因的组成型表达。结果,所述方法可以全面搜索先前是不可能被捕获的
“在细胞生理学改变过程中瞬时表达的基因”以及先前捕获的基因。该系统使得可以构建一个数据库以了解基因表达的动态改变。
本发明提供了一种基因捕获方法,包括如下步骤(第一步)用报道基因载体转化靶细胞,(第二步)用捕获载体转染在前一步骤中转化的细胞,(第三步)从在前一步骤获得的细胞中选择无报道基因活性的细胞,(第四步)将在前一步骤中选择的细胞暴露于给定条件,及(第五步)从前一步骤的细胞中选择具有报道基因活性的细胞,其中报道基因载体具有通过将在靶细胞中起作用的启动子、第一个LoxP序列、药物抗性基因、转录终止的STOP序列、第二个LoxP序列及一个报道基因依次连接而组成的一个单元,而且基因捕获载体具有通过将剪接受体(splicingacceptor,SA)、内部核糖体进入位点(IRES)、添加有核定位信号的Cre(nl-Cre)、第一个剪接供体(SD)、组成型表达基因启动子、药物抗性基因和第二个剪接供体(SD)依次连接而组成的一个单元。
另外,所述方法可进一步包括第六步,即在第五步选择的细胞中克隆与捕获载体最接近的DNA并确定核苷酸序列。
再者,本发明提供了包含一个报道基因载体和一个基因捕获载体的一套基因捕获载体,其中报道基因载体包含通过将在靶细胞中起作用的启动子、第一个LoxP序列、药物抗性基因、转录终止的
STOP序列、第二个LoxP序列和一个报道基因依次连接而组成的一个单元,且基因捕获载体包含通过将剪接受体(SA)、内部核糖体进入位点(IRES)、添加有核定位信号的Cre(nl-Cre)、第一个剪接供体(SD)、组成型表达基因启动子、药物抗性基因和第二个剪接供体(SD)依次连接而组成的一个单元。
另外,本发明提供了通过该套载体转化的细胞或者含有所述细胞的非人动物。
附图简述
图1示出本发明的捕获载体的基本单元。
图2示出本发明的报道基因载体的基本单元。
图3示出实施例2中构建的报道基因载体的基本单元。
图4示出解释实施例4中每个步骤的示意图。标记A和B代表LacZ阳性样品,标记B示出标记的细胞含有一个捕获的基因,其在ES细胞分化期间诱导捕获载体中Cre基因的表达。
图5代表细胞的照片,示出LacZ阳性仅在分化的诱导之后。LacZ阳性细胞团在细胞簇(clump)的中心检测到(箭头所示),颜色是深蓝色。这些细胞相应于图4右侧的标记B。
发明详述本发明的系统包含两个元件捕获载体和报道基因载体。
(1)捕获载体pMIE这个捕获载体的基本单元示于
图1。该基本单元结构大致由两部分组成。
第一部分由剪接受体(SA)、内部核糖体进入位点(IRES)、添加有核定位信号的Cre(nl-Cre)及第一个剪接供体(SD)依次连接组成。
第二部分由组成型表达基因启动子(例如PGK基因启动子)、药物抗性基因(例如Neo基因)和第二个剪接供体(SD)依次连接组成。
另外,可以在这些部分的每个元件之间插入无功能活性的DNA序列。
剪接受体(SA)是一个信号序列,位于剪接(切下内含子并与编码氨基酸的部分连接的步骤)必需的内含子的下游,作为转录后控制。
剪接供体(SD)是SA的一个“剪接控制顺式元件”,是位于内含子上游的一个功能序列。
IRES是启动蛋白质合成的核糖体的复合形成或进入位点。
IRES是人脑心肌炎病毒基因组的一部分,商购载体的相应部分的分离的PCR产物可用作IRES。
Cre是一种重组酶。
PGK基因启动子是一种管家基因启动子,其不易于受染色体包埋位点(chromosomalembeddedsite)(捕获的位点)的影响。
药物抗性基因可以是任何基因,其编码的蛋白质抵消对哺乳动物细胞的药物毒性作用。最常用的是
Neo抗性基因。
将这些单元导入合适的载体中。作为载体,可以使用BluescriptSKII(Stratagene)。
捕获载体具有如下功能特点第一部分中的剪接受体除了基因的启动子捕获之外还使得发生5’(上游侧)外显子捕获。
由IRES捕获的不具翻译起始序列的基因得以从Cre基因开始翻译,这不依赖于基于mRNA的帽结构的翻译起始。
第二部分中的药物抗性基因伴随下游的剪接供体,但无polyA添加信号。因此,基于药物抗性的选择使得3’外显子的捕获和polyA添加信号得以发生。使用药物抗性基因序列作为引物,分离自捕获的ES细胞克隆的RNA使得一部分捕获的基因通过3’RACE可以扩增并迅速鉴别。
无polyA添加信号的捕获载体使得可以进行低背景筛选。另外,针对捕获的EC细胞克隆分离的RNA使得捕获基因的一部分核苷酸序列可以通过3’RACE扩增并迅速鉴别。
(2)报道基因载体pRMIE
如图2所示,报道基因载体包含由在靶细胞中起作用的启动子、第一个LoxP序列、药物抗性基因、转录终止的STOP序列、第二个LoxP序列及一个报道基因依次连接组成的一个单元。另外,在所述单元的每个元件之间可以插入非功能性的DNA序列。
用于转录终止的STOP序列可以是含有终止密码子的基因
(cDNA)或者是polyA添加信号。可以使用含有polyA添加信号和翻译终止密码子的部分商购载体。
将这些单元导入适当的载体中。作为载体,可以使用BluescriptSKII(Stratagene)。
本发明的方法包括如下步骤第一步在这个步骤中,将在两种细胞状态如分化或恶性转化之间可改变的靶细胞用报道基因载体转染并建立细胞系。任何细胞均可用作靶细胞,但胚胎干细胞(ES细胞)具有如下三个优点。
可以在多能(pluripotent)ES细胞的趋异细胞分化期间搜索用于细胞分化的瞬时表达的关键基因。
由于捕获的基因通常导致功能异常(缺失或降低),因此可以使用捕获的ES细胞克隆构建突变的动物。
由于Cre基因用基于本发明捕获载体的结构的捕获基因的表达取代,因此通过捕获的ES细胞克隆构建的动物可以用作“Cre动物”(组织和细胞类型特异性遗传重组必需的动物)。
第二步在这个步骤中,将捕获载体转导至在前一步骤中转化的靶细胞中。
第三步从通过第二步获得的细胞中选择无报道基因活性的细胞。
第四步将在前一步骤中选择的细胞暴露于给定条件,可以特别检测在由新条件引起的细胞中瞬时表达的基因。
第五步从前一步骤的细胞中选择具有报道基因活性的细胞。在这个步骤中,足以通过依赖于报道基因性质的合适方法分析所述活性。
第六步克隆在前一步骤中选择的细胞中与捕获载体最接近的DNA并测定这个序列。这个步骤可以通过常规方法进行。另外,只是为了获得在第五步中选择的细胞则可以省略这个步骤。
如下实施例举例阐述了本发明,然而,这些实施例无限制本发明之意。
实施例1捕获载体的构建捕获载体(pMIE-nlCre,
图1)通过在BluescriptSKII(-)(一种克隆载体,Stratagene,USA))中XbaI-SalI位点之间依次连接剪接受体(SA)、内部核糖体进入位点(IRES)、具有核定位信号的Cre(nl-Cre)、剪接供体(SD)、PGK基因启动子、药物抗性基因(例如Neo)及剪接供体(SD)而构建。
作为剪接受体,使用II型ryanodine受体基因中第二个外显子的受体区域(SEQIDNO1,大约50bp的BglII-PstI片段的DNA,分离及纯化自商购自Stratagene,USA的基因组文库“LamdaFIXII”)。
作为IRES,使用从商购的pCITE表达载体(Novagen)的相应部分中使用SEQIDNO2和3所示引物扩增的PCR片段。
由于重组Cre蛋白在核内是功能性的,因此使用具有编码翻译起始位点的序列上游的SV40T抗原核定位信号的nl-Cre(SEQIDNO4)
作为Cre基因。
作为PGK启动子,使用小鼠磷酸甘油酸激酶基因的启动子,其不影响整合基因的转录控制。
使用pQG44(O’GormanS,FoxDT,WahlGM(1991),Recombinase-,251(4999)1351-1355)中合成内含子的PCR扩增的XbaI-SacII片段(SEQIDNO5)作为剪接供体。
使用合成的寡聚物(SEQIDNO6),BluescriptSKII(-)的SpeI位点被改变为PmeI位点,以在导入靶细胞之前将BluescriptSKII(-)部分与捕获载体分开。
实施例2报道基因载体(pRMIE-nlLacZ)的构建报道基因载体pRMIE-nlLacZ通过在用于基因克隆的载体BluescriptSKII(-)的NotI-SalI位点之间插入并依次连接在所有类型的靶细胞中均起作用的CAG启动子、第一个LoxP序列、嘌呤霉素抗性基因(Pac)、转录终止的STOP序列、第二个LoxP序列、大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因和polyA添加信号而制备(图3)。
CAG启动子是一种合成的启动子,包含巨细胞病毒增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和兔β-珠蛋白基因的一个外显子。STOP序列是衍生自pBS302(GENEBANKNOU51223)的HindIII-BamHI片段()。
将核定位信号加入大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因。
由于这个结构,Cre蛋白的存在导致LoxP序列的重组、STOP序列的切除及位于起始处下游的β-半乳糖苷酶基因的转录。
实施例3报道基因载体转导入ES细胞及报道基因细胞的选择RW4(GenomeSystem)用作ES细胞。基本上根据报道的方法进行细胞培养和靶定程序(,Development.,122(11),3587-95(1996))。
首先,将5×,并通过用GenePulser(Bio-Rad,400V,25μF,)进行电脉冲将DNA转导入细胞中。
在电脉冲后,将细胞在已经在10cm培养皿底部培养为单层的饲养细胞上培养。作为饲养细胞,。在开始培养后24、,再持续12小时,洗涤并更换为正常培养基。通过重复这些步骤,选择在其染色体中掺入了报道基因载体的嘌呤霉素抗性ES克隆。
在开始培养7天后,将大约200个嘌呤霉素抗性菌落移至96孔平板中并继续培养。当细胞充分生长时,将每个平板分成三个
96孔平板。在细胞进一步生长后,将第一个平板在-85℃保存在冰箱中,第二个平板用于分析β-半乳糖苷酶活性,第三个平板用于分析在导入Cre表达载体(pBSCAGCre)后β-半乳糖苷酶活性。
报道基因细胞中大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因是沉默的并且不被翻译为蛋白质,因为其上游存在在两个LoxP序列之间插入的嘌呤霉素基因和STOP序列。因此,大肠杆菌β-半乳糖苷酶活性在没有Cre表达的报道基因细胞中检测不到。从仅在导入Cre表达载体之后具有β-半乳糖苷酶活性的细胞中选择一些克隆,生长并以冷冻状态保存作为报道基因-ES细胞以进行基因捕获。使用Rosch的Fugenekit,将Cre强制表达载体pBSCAGCre转导进入细胞中。
实施例4基因捕获载体转导进报道基因ES细胞及基因捕获的候选细胞的选择图4示出解释这个实施例的每个步骤的示意图。将5×107个报道基因ES细胞与用PmeI和SalI线性化的50μg捕获载体pMIE混和,并用GenePulser(Bio-Rad,400V,25μF,)通过电脉冲将线性化的载体转导入细胞中。转导24小时后,向培养基中加入160μg效价/ml的抗生素G418,并开始选择抗性菌落。在开始培养后7天,将大约200个菌落的G418抗性细胞移至96孔平板中并将细胞充分生长。
在此阶段,细胞克隆的G418抗性归因于从Neo基因开始的稳定转录和翻译,其保证通过捕获载体经过