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基于酵母dna损伤响应的生物传感器元件盒及其应用的制作方法.docx


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专利名称:基于酵母dna损伤响应的生物传感器元件盒及其应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及生物技术,尤其涉及经过遗传基因改造的微生物对环境化学污染物的监测。
背景技术:
面包酵母是一种简单真核生物,单细胞,遗传改造操作简单,培养简便快速且环境友好,适合作为一种模式生物应用于生命科学研究中。目前在环境污染检测技术领域中,面包酵母作为一种简单真核生物越来越被受到重视,一些以面包酵母为模式生物的检测系统得到了发展。遗传毒性致癌物是指能与DNA反应,引起DNA损伤而致癌的化学致癌物,可用生物化学试验或间接地应用遗传毒性试验方法来鉴定遗传毒性致癌物,包括直接致癌物和间接致癌物。遗传毒性致癌物的检测对于环境监测及保护有重大的现实意义。构建一个检测DNA损伤的生物传感器系统,除宿主细胞外,需具备以下两个基本元件感应元件和连接于此后的效应元件。前者利用其自身功能可对DNA损伤进行响应,并开启后者的表达,从而产生可检测出的信号。将这两个元件组合在一起的基因片段称为生物传感器元件盒。核糖核苷酸还原酶
(Ribonucleotidereductase,RNR)是催化核糖核酸转变为脱氧核糖核苷酸为DNA合成和修复提供所需dNTPs的限速酶。核糖核苷酸还原酶(RNR)在DNA的复制和修复中具有重要的作用,维持着细胞的脱氧核糖核酸库存,并因此在细胞周期过程中被严格控制以确保DNA复制的高保真。酵母细胞中所存在的RNR包含有四种亚单位(MNRURNR2、RNR3、7麗¥),其中RNR3编码核糖核苷酸还原酶大亚基,非酶活力所必需,在细胞正常生长条件下几乎无表达,一旦机体DNA发生损伤或合成受到抑制时,可诱导其及时大量表达。研究表明酵母可为DNA损伤的紧急修复提高大量dNTPs,RNR3转录后mRNA受DNA损伤诱导表达量可增加100多倍。这一特点使可作为制备生物传感器的感应元件。绿色荧光蛋白(GFP)是从水母中分离出的天然生物发光蛋白,其性质稳定,无需添加任何底物及辅助因子,即在紫外或蓝光的激发下发出绿色荧光。它在细菌、真菌、植物和动物细胞中表达时都能发出荧光,具有活体、原位、实时表达的特点。而酵母增强型绿色荧光蛋白(yEGFP)是一种密码子优化后的增强型绿色荧光蛋白,它可在酵母细胞中增强表达。对比此前广泛使用的编码B-gal半乳糖苷酶的报告基因IacZ,GFP具有直接用于活体细胞检测,并可克服利用酶作为报告基因的一系列缺点(破坏酵母细胞壁,影响酶活显色的因素复杂等),使检测手段多样、自动化等一系列优点。利用绿色荧光蛋白作为制备生物感应器的效应元件,使得环境中遗传毒性致癌物测评体系更有利地向高通量,快速,
便捷的阶段发展。利用SOE法(GeneSplicingbyOverlapExtension)进行PCR基因片段拼接,即通过PCR过程中基因片段的交错延伸实现拼接。该方法是利用PCR技术在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,该技术使用简易。由于引物只需要与模板有效结合,尤其是5’端序列不必与模板完全配对,因此扩增引物的5’端可以添加两种酶切位点以便于后期克隆。流式细胞技术是分析细胞中的一个重要领域,该技术为细胞学研究手段之一,能够对细胞和细胞器及生物大分子进行高达每秒上万个细胞个体的分析,而且一个细胞多参数分析并可分选细胞。这种以流动的方式(相对静态方式)测量细胞与传统的用荧光镜检测细胞比较,具有速度快,精度高,准确性好的特点。
发明内容
本发明的目的是,提供一种基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒及其构建方法,其核心内容是构建生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYCl,并将该生物传感器元件盒转入复合DNA损伤超高敏感型面包酵母七基因缺失突变株基因组中进行应用,可检测多种
遗传毒性致癌物,大大提高该生物传感器对检测环境中遗传毒性化学物质的敏感性,扩大其检测应用范围,增强其检测的应用潜力。为了达到上述目的,本发明采用如下技术方案
(一)、一种基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYCl的构建方法

(1)提取野生型面包酵母基因组DNA,通过特异性引物,以面包酵母基因组DNA为模板,PCR扩增得到RNR3启动子基因片段;
(2)提取质粒PUG36,通过特异性引物,以该质粒为模板,PCR扩增得到编码区基因片段;
(3)提取质粒PUG36,通过特异性引物,以该质粒为模板,PCR扩增得到终止子CYCl基因片段;
(4)利用SOE法,通过特异性引物,以上述三个基因片段共同为模板,PCR扩增得到基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYCl;
(二)、将基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYCl转入复合DNA损伤超高敏感型面包酵母七基因缺失突变株基因组中,应用于遗传毒性致癌物的检测
(I)将基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYCl转入到复合DNA损伤超高敏感型面包酵母七基因缺失突变株基因组中,形成敏感的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器_7雄^AcwplAcwp2Asnq2Apdr5AradAmagiA-RNR3_yEGFP_CYCI;
其中复合DNA损伤超高敏感型面包酵母七基因缺失突变株是在对氧化损伤高敏感性的五基因缺失面包酵母突变株(专利申请号20**********)的基础上,敲除与DNA损伤修复有关的姻67和似汉/基因,获得缺失cwplcwp2snq2pdr5radl七基因的面包酵母突变株。(2)基于酵母DNA损伤响应的生物传感器对遗传毒性致癌物的响应,可利用流式细胞仪技术、荧光显微镜或荧光分光光度计,通过测定绿色荧光蛋白表达的变化情况从而对遗传毒性致癌物进行检测。本发明的优点与效果
基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒关键性优点在于,它使检测操作更简便,人为误差小,可直接观察,可以灵活使用多种检测手段,具有发展为大批量乃至高通量的遗传毒性致癌物环境实时现场监测的潜力。与宿主为野生型酵母株相比,本发明中宿主为复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因突变株的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器,对各类型遗传毒性化学物质的响应敏感度均有明显提闻。对于甲横酸甲酷(MMS)在极低浓度下(25ppm)的检测灵敏度提闻至35倍;;对腐草霉素(Pleomycin)在
;宿主为野生型面包酵母的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器,不能检测到低浓度的叔丁基过氧化氢(t-BHP)及DNA损伤剂4-硝基喹啉
I-氧化物(4-NQ0)引起的DNA损伤信号,而宿主为复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因突变株的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器均可检测到这两种致DNA氧化损伤化合物,并且有较高的检测灵敏度。因此基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP~CYCl在复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因突变株中的应用可提高其检测灵敏度并扩大其检测范围,使其更有利于今后发展为对环境遗传毒性致癌物的在线实时监测平台中的核心技术。表I、基于酵母DNA损伤响应的生物传感器与四种现有的生物传感器对五种遗传毒性致癌物检测灵敏度的比较分析,
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中所示数值为诱导倍数,表示生物传感器对该遗传毒性致癌物检测得到的信号强度,与空白对照的检测信号强度相除后的检测结果;无检测表示检测系统对该遗传毒性致癌物没有进行检测。
图I、基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒应用于不同面包酵母基因突变株中对DNA烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)检测灵敏度的比较。图中横坐标表不DNA烧化剂甲磺酸甲酯
(MMS)的浓度;纵坐标表不基于酵母DNA损伤响应的生物传感器对DNA烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)检测所得到的相对荧光强度诱导倍数;一一曲线表示基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒应用于宿主为野生型面包酵母中对DNA烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)的检测结果;一s—曲线表示于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒/应用于宿主为复合DNA损伤超高敏感型面包酵母七基因缺失突变株中对DNA烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)的检测结果。
具体实施例方式一、制备基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒的方法,该方法包含下列步骤
1、从野生面包酵母中提取基因组DNA
la、取野生面包酵母,接种于YPD培养液中,在30°C,200转/分钟的条件下,振荡培养16小时,得到野生面包酵母菌液;
其中YPD培养液的配方重量百分比为酵母膏1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%,余者为水;Ib、,用4000转/分钟离心2分钟,取沉淀物悬于200微升提取缓冲液中;
其中提取缓冲液的配方为曲拉通X-1002%,十二烷基磺酸钠1%,***,乙二***四乙酸I毫摩尔,三羟***氨基甲烷盐酸盐10毫摩尔,余者为水,;
lc、、100微升酚、100微升***仿,震荡
3分钟后,以12000转/分钟离心10分钟,取上层液体;
Id、加入所取液体体积2倍的无水乙醇,在_20°C静置30分钟,以12000转/分钟离心15分钟,去上清,取沉淀物;
le、将沉淀物溶解于20微升无菌水,即为野生酵母基因组DNA;
2、扩增启动子基因片段
野生酵母基因组DNA作为扩增模板,通过上游引物RNR3Pro-1:5’AACTGCAGCAAGCACATAAAAAATCAG3,和下游引物RNR3Pro-2:5,TTAGACATTTGTGTGGGAGTATTTGATT3’,利用PCR技术,扩增得到启动子基因片段(600bp);
3、扩增编码区基因片段以及终止子CTC7基因片段
质粒PUG36(美国ATCC公司提供)作为扩增模板,通过上游引物yEGFP-1:5’CCACACAAATGTCTAAAGGTGAAGAATT3’和下游引物yEGFP-2:5’TACATGACTTTGTACAATTCATCCATAC3’,利用PCR技术,扩增得到编码区基因片段(750bp);
质粒PUG36作为扩增模板,通过上游引物CYCl-1:5,TGTACAAAGTCATGTAATTAGTTATGTC3,和下游引物CYCI-2:5’TCCGGAATTCGGTACCGGCCGCAAATTAAAG3’,利用PCR技术,扩增得到终止子C7C7基因片段(260bp);
4、扩增基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒欣基因片段
用启动子基因片段、编码区基因片段及终止子C7C7基因片段按照摩尔比I:I:I的比例为扩增模板,通过上游引物RNR3Pro-1:5’MCTGCAGCAAGCACATMAAMTCAG3,和下游引物CYCI-2:5,TCCGGAATTCGGTACCGGCCGCAAATTAAAG3,,利用PCR技术,扩增得到基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒基因片段;
上述PCR的条件为94°C5分钟;94°C45秒,55°C45秒,72°CI分钟,30个循环;72°C5分钟。
二、用基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒/基因片段构建基于酵母DNA损伤响应的生物传感器,该构建方法包含下列步骤
(1)、在五基因缺失的对氧化损伤高敏感性的面包酵母(专利申请号为20**********)的基础上,再敲除与DNA损伤修复有关的姻似和似见基因,获得复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株,步骤如下
la、将质粒dmagi::hisG_URA3_hisG(参考文献JinChen,etal.(1990)Saccharomycescerevisiae3-,,-4575)用限制性内切酶/和汝37//进行酶切,得到敲除组件^^d::hisG-URA3~hisG;

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