培育食用菌高硒耐受性菌种的方法.docx

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专利名称:培育食用菌高硒耐受性菌种的方法
技术领域:
本发明涉及高硒材料的制备方法,具体是指一种培育食用菌高硒耐受性菌种的方法。
背景技术:
硒是人和动物体内必需的微量元素,是构成谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、硒蛋白P等多达23种功能蛋白的活性中心,具有以下功效(1)清除体内过氧化物、自由基,保护细胞结构与功能不受干扰与损害,延缓衰老;(2)加速致癌物质的代谢,促进DNA损伤修复,降低癌症发病率;(3)拮抗体内有毒物质,降低其毒性,有效保护肝脏;(4)增强机体细胞免疫功能,提高机体免疫力。而硒的严重缺乏会直接导致克山病和大骨节病,其中克山病最早发现与70年代的黑龙江克山县,是以心脏呈不同程度的扩张,严重时呈球形,心肌有散在不同程度的坏死灶及斑痕区为主要表现的心肌病;大骨节病是以骨关节增粗、畸形为主要表现的一种地方病。土壤缺硒是全世界广泛存在的问题,尽管我国的湖北恩施有世界硒都之称,陕西紫阳也是一个富硒区,但是我国存在一个从东北黑龙江省一直延伸到西南云南省的低硒带,占据我国国土面积的72%。在这些低硒区,农作物等食物的生长过程中无法从土壤中获取充足的硒,从而形成食物链的普遍缺硒状态,因此这些区域的人体内也处于缺硒的状态,
研究显示中国人均日摄入硒的总量约为35yg,显著低于世界卫生组织(WHO)推荐的硒日摄入量50-200μg。因此,补充硒的有效摄入成为我国低硒地区的迫在眉睫的问题。食用菌因其具有繁殖时间短、生物量大、蛋白含量高等特点,同时具有传统的保健功能,而且对硒具有一定的富集作用,对其进行富硒研究和开发具有广阔的应用前景。但是,目前的专利主要集中在对食用菌的富硒营养强化、作为直接食用的农产品进行开发,如富硒秀珍菇菌粉的制备方法()、富硒双孢菇的工厂化栽培方法(),尚未开展任何将食用菌作为高硒载体、作为食品、保健品的添加剂的形式进行开发。目前有两项专利在菌种的富硒驯化上开展了一些工作,如富硒香菇菌种驯化与栽培方法()、富硒桑黄菌菌种驯化、栽培、富集方法(),但是其只经过简单的两级驯化,其目的也不是获取最大耐硒浓度的菌种,而且利用以上两种专利中的简单两级驯化方法并不能获得高硒耐受性菌种。本发明因此而来。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育食用菌高硒耐受性菌种的方法,进而获取高硒食用菌材料,为开发更丰富、更有效的补硒产品提供优质的材料。本发明的技术方案如下一种培育食用菌
高硒耐受性菌种的方法,其特征在于所述方法包括以下步骤(1)根据食用菌菌种选择适应食用菌菌种生长的培养基,将食用菌菌种接入培养基中进行试管菌种培养得到初始菌悬液;
(2)将培养基与硒源混合配制成梯度硒浓度的耐硒培养基,采用菌悬液接种方式将食用菌菌种接种到灭菌处理后的耐硒培养基上按照硒浓度从低到高的顺序按照常用的食用菌菌种培养方式逐一硒浓度进行耐硒培养;首次耐硒培养使用的菌悬液为初始菌悬液,耐硒培养得到的菌悬液为下一硒浓度进行耐硒培养使用的菌悬液,依次类推;当食用菌菌种生长出现下列情形之一时i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上;ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下,甚至不生长;iii)菌株明显变色;且相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值在预定阈值内时,停止耐硒培养,并确定食用菌的最佳耐受硒浓度为前一批次耐硒培养基的硒浓度;(3)根据步骤(得到的食用菌的最佳耐受硒浓度采用菌悬液接种方式,进行连续转接培养,并确定菌种的耐硒性状稳定,即得到食用菌高硒耐受性菌种。优选的,所述方法中当食用菌菌种生长出现下列情形之一时i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上;ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基
培养时的30%以下,甚至不生长;iii)菌株明显变色;当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时,调整耐硒培养基的硒浓度,使耐硒培养基的硒浓度大于前一批次耐硒培养基的硒浓度,且耐硒培养基的硒浓度小于当前批次耐硒培养基的硒浓度,然后以调整硒浓度后的耐硒培养基按照步骤O)的方法继续进行耐硒培养。优选的,所述方法中调整耐硒培养基的硒浓度是根据预定阈值或预定阈值的整数倍数进行调整,当食用菌菌种生长出现下列情形之一时i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上;ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下,甚至不生长;iii)菌株明显变色;当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时,调整耐硒培养基的硒浓度为当前批次耐硒培养基的硒浓度减去预定阈值或预定阈值的整数倍数后的硒浓度。优选的,所述方法中调整耐硒培养基的硒浓度是根据相邻批次耐硒培养基的硒浓度进行调整,当食用菌菌种生长出现下列情形之一时i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上;ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下,甚至不生长;iii)菌株明显变色;当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时,调整耐硒培养基的硒浓度为相邻批次耐硒培养基的硒浓度的平均值。优选的,所述方法中适应食用菌菌种生长的培养基为PDA综合培养基。
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优选的,所述方法中PDA综合培养基每IOOml定容培养基中,所用原料为马铃薯20g,葡萄糖2g,,MgSO4·,,,。优选的,所述方法中所述PDA综合培养基的配制方法包括先将应加入的马铃薯与蒸馏水混勻,保持沸腾30分钟后过滤,加入其他原料并充分混合后定容至所需体积的步
马聚ο优选的,所述方法中硒源选自亚硒酸钠、硒酸钠或富硒酵母粉。优选的,所述方法步骤(3)中进行连续转接培养时,出现以下情形a)菌种无法生长;b)菌种生长周期差异明显;c)菌种生物量差别明显;d)菌株明显变色;则判断不满足耐硒性状稳定的条件;否则认为耐硒性状稳定。优选的,所述方法还包括在步骤C3)获得食用菌高硒耐受性菌种后将所获得的高硒耐受性菌种接入到含最佳耐硒浓度的含硒PDA综合培养基的固体斜面上培养,并于_80°C甘油管中作为高硒耐受性菌种保存的步骤。所述的预定阈值为根据食用菌耐硒培养的需要和其他因素确定的硒浓度变异的值,可以是恒定的值,也可以是变动的值,如递归减小的值。具体的,本发明培育食用菌高硒耐受性菌种的方法,按照以下步骤进行(1)将食用菌菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养;(2)将硒源与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合,制作成由低
(一级)到高(N级)的系列浓度梯度的含硒培养基,然后灭菌;(3)采用菌悬液接种方式,将步骤1培养的试管菌种接入步骤2制备的一级含硒培养基中,进行食用菌菌种一级耐硒培养;(4)采用菌悬液接种方式,将步骤3培养的一级耐硒菌种接入步骤2制备的二级含硒培养基中,进行食用菌菌种二级耐硒培养;(5)依此类推,直至食用菌菌种生长出现下列情形之一(1)菌株生长周期延长至对照组的一倍以上;(菌种生物量下降至对照组的30%以下,甚至不生长;C3)菌株明显变色;则停止耐硒培养;(6)将出现步骤5中抑制现象的培养基硒浓度和出现步骤5中抑制现象的前一硒浓度的中值硒浓度作为进一步的优化培养浓度;(7)重复步骤5和6,直至找到食用菌菌种的最佳耐硒浓度;(8)在最佳耐硒浓度下采用菌悬液接种方式,连续转接3次,保证菌种的耐硒性状稳定;(9)将所获得的高硒耐受性菌种接入到含最佳耐硒浓度的含硒PDA综合培养基的固体斜面上培养,并于-80°C甘油管中作为高硒耐受性菌种保存。所述高硒耐受性菌种是指该菌种经过逐级耐硒培养,直到出现下列情形之一所获得的菌种(1)菌株生长周期延长至对照组的一倍以上;(菌种生物量下降至对照组的30%以下,甚至不生长;C3)菌株明显变色。所述对照组通常采用前一硒浓度的耐硒培养基。
所述PDA综合培养基配方为每IOOml定容培养基中,所用原料为马铃薯
20g,葡萄糖2g,,MgS04·,,,;所述PDA综合培养基配置方法是先将应加入的马铃薯与蒸馏水混勻,保持沸腾30分钟后过滤,力口入其他原料并充分混合后定容至所需体积。所述硒源是指亚硒酸钠、硒酸钠或富硒酵母粉。所述耐硒性状稳定是指在转接3次的过程中,未出现以下情形(1)菌种无法生长;(菌种生长周期差异明显;C3)菌种生物量差别明显;(4)菌株明显变色。本发明判断不进行耐硒培养的标准是通过食用菌菌种生长是否出现明显抑制现象来进行的。食用菌菌种生长出现明显抑制现象是指出现下列情形之一(1)菌株生长周期延长至对照组的一倍以上;(菌种生物量下降至对照组的30%以下,甚至不生长;(3)菌株明显变色。另外还需要判断高硒耐受性食用菌菌种的稳定性情况,申请人确定耐硒性状稳定按照以下标准在转接3次的过程中,未出现以下情形(1)菌种无法生长;(菌种生长周期差异明显;C3)菌种生物量差别明显;(4)菌株明显变色。相比于现有技术,本发明具有以下有益效果1、大幅提高食用菌的高硒耐受性经过食用菌菌种的高硒耐受性培养后,其在液体深层培养的状态下,对培养基中的硒含量的耐受性大幅提高,一般是对照状态的3-5倍;2、大幅提高食用菌中的硒含量经过食用菌菌种的高硒耐受性培养后,其在液体深层培养的状态下,其富集硒的能力大幅提高,体内的总硒含量可达对照组的
10倍以上,其中以硒代蛋氨酸为主;3、大幅缩短食用菌液体深层培养的生长周期经过食用菌菌种的高硒耐受性培养后,其在液体深层培养的状态下,生长周期缩短至对照组的2/3-1/2;4、可生产高硒材料通过食用菌菌种的高硒耐受性培养后,其在液体深层培养的状态下,可获得高硒材料,一般菌种的高硒含量可达1000毫克/千克(干重)以上,而灵芝的高硒含量可达10000毫克/千克(干重)以上。这些高硒材料可作为食品、保健品的优质硒源添加剂。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明,但不能用来限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件作进一步调整,未说明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例1获取灵芝高硒耐受性菌种的步骤(1)高硒耐受性灵芝菌种的制备1)从中国科学院菌种保藏中心购买灵芝菌种()。2)将灵芝菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。3)将亚硒酸钠(NajeO3)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合,制作NajeO3含量为2、20、50、100、200、400、600、800、1000mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基,然后灭菌备用。4)采用菌悬液接种方式,将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的ang/L的含硒培养基中,进行灵芝菌种一级耐硒培养。5)一级耐硒培养完成后,采用菌悬液接种方式,将步骤4培养的一级耐硒菌种接入步骤3制备的20mg/L的含硒培养基中,进行灵芝菌种二级耐硒培养。
6)依此类推,直至灵芝菌种在200mg/L的含硒培养基中,出现生长缓慢、生物量显著降低、变色等明显抑制现象,停止耐硒培养。7)以抑制浓度200mg/L和前一浓度100mg/L的中值硒浓度150mg/L作为进一步的优化培养浓度。8)将在200mg/L的含硒培养基中生长的灵芝菌种采用菌悬液接种方式接入经灭菌处理后的150mg/L的含硒培养基中,进行一级优化培养。9)一级优化培养完成后,将步骤8培养的一级优化灵芝菌种接入175mg/L(步骤8中的硒浓度与抑制浓度的中值硒浓度)的含硒培养基中,进行二级优化培养。10)在步骤9中,灵芝菌种出现如步骤6中的抑制现象,停止培养。11)以步骤9中的硒浓度与步骤7中的硒浓度的中值浓度160mg/L作为进一步的优化培养浓度。12)将步骤9中生长的灵芝菌种接入到步骤11中的灭菌含硒培养基中,生长正常,可作为该灵芝菌种的最佳耐硒浓度。13)在160mg/L含硒培养基下采用菌悬液接种方式,将步骤12中生长的菌种连续转接3次,保证菌种的耐硒性状稳定。14)将步骤13中所获得的高硒耐受性灵芝菌种接入到160mg/L含硒培养基的固体斜面上培养,并于-80°C甘油管中作为高硒耐受性灵芝菌种保存。(2)高硒耐受性灵芝菌种的应用将上述获得的高硒耐受性灵芝菌种与未经过高硒耐受性培养的同一灵芝菌种逐级接入到灭菌处理后的200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、
1400、1500mg/L亚硒酸钠的液体发酵培养基中进行液体深层发酵富硒培养,监测其生长规律,并检测成熟灵芝菌丝体中的硒含量。(3)实施效果灵芝高硒耐受性提高经过灵芝菌种的高硒耐受性培养后,其在液体深层培养的状态下,对培养基中的硒含量的耐受性可达1200mg/L,是对照状态的3倍。灵芝硒含量提高经过灵芝菌种的高硒耐受性培养后,其在液体深层培养的状态下,其富集硒的能力大幅提高,体内的总硒含量在最高耐硒度(1200mg/L)条件下可达对照组中最高总硒含量的10倍以上,其中硒存在的形态以硒代蛋氨酸为主。大幅缩短灵芝液体深层培养的生长周期经过灵芝菌种的高硒耐受性培养后,其在液体深层培养的状态下,生长周期缩短至对照组的1/2。可生产高硒材料通过灵芝菌种的高硒耐受性培养后,其在液体深层培养的状态下,可获得灵芝高硒材料,最高硒含量可达18000毫克/千克(干重)以上,且以安全有效的有机硒存在,可作为食品、保健品的优质硒源添加剂。实施例2获取云芝高硒耐受性菌种的步骤(1)高硒耐受性云芝菌种的制备1)从中国科学院菌种保藏中心购买云芝菌种()。
2)将云芝菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。3)将硒酸钠(NajeO4)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合,制作NajeO4含量为2、20、50、100、200、400、600、800、1000mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基,然后灭