均相分子灯标荧光探针pcr乙肝病毒检测方法和试剂盒的制作方法.docx

该【均相分子灯标荧光探针pcr乙肝病毒检测方法和试剂盒的制作方法 】是由【421989820】上传分享，文档一共【12】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【均相分子灯标荧光探针pcr乙肝病毒检测方法和试剂盒的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。均相分子灯标荧光探针pcr乙肝病毒检测方法和试剂盒的制作方法
专利名称:均相分子灯标荧光探针pcr乙肝病毒检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种PCR乙型肝炎病毒的检测方法,即应用分子灯标探针进行乙型肝炎病毒DNAPCR扩增产物的检测。本发明涉及应用分子灯标探针进行乙型肝炎病毒DNAPCR扩增产物检测的试剂盒。
背景技术:
乙型肝炎病毒感染是一种世界性传染病,它可以引起病人的身体极度衰弱甚至导致死亡。估计目前全世界范围内大约有2亿人口为乙肝病毒携带者,而我国就有1亿,为乙肝的高流行区,同时也是肝癌的高发国家,因此,研究乙型肝炎病毒的分子生物学特点,采用现代分子生物学技术探讨诊断和防治方法,是十分必要的。
对乙型肝炎病毒感染的诊断,目前仍然依据反向间接血凝实验(RPHA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)或放射免疫实验(RIA)等方法检测其血清标志物。但上述血清免疫学检测方法存在灵敏度低的缺点,很多血清学检测各项指标均阴性的标本,经PCR扩增后检测仍存在低含量的乙型肝炎病毒DNA。且血清标记物的出现要滞后于乙型肝炎病毒的感染,不利于感染的早期诊断,据世界卫生组织综合各国资料表明,输血后乙型肝炎发生率超过
‰,这主要是由以往筛选献血员方法的灵敏度不够所造成的。
PCR作为一种DNA的体外扩增技术,可在数小时内获得数百万个特异DNA序列拷贝,现已被广泛地应用于乙型肝炎病毒的诊断研究,并取得了良好的效果。对PCR扩增产物的鉴定通常采用的是琼脂糖凝胶电泳-EB染色法,但在电泳结果的判定上存在着较大的人为因素,如在引物二聚体、非特异扩增条带的辨别上带有明显的个人化特征,结果的准确性较差。在此情况下,使用针对特定靶序列的特异性探针与扩增产物进行特异杂交,能较好地提高检测的灵敏度和特异性。目前使用的杂交检测方法多为非均相杂交检测,如中国专利CN1061686C中在进行PCR产物的检测时,所采用的方法是将核酸探针点样于检测膜上,在与生物素标记的PCR产物结合后,利用生物素与亲和素之间的相互作用,标记以碱性磷酸酶,最后加入适当的酶底物显色检测。该发明虽然提供了一种相对简单的核酸分子检测方法,但仍无法摆脱非均相杂交检测所需要的点样-杂交-酶标-显色进行一系列烦琐的操作,费时费力,十分不便。
分子灯标探针已成功地应用在了结核杆菌的检测研究(CN1281901A)及细胞内的基因分析研究中(CN1308135A),但在乙型肝炎检测研究中的应用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种均相分子灯标荧光探针PCR乙肝病毒检测方法和试剂盒。本发明改善了PCR检测的灵敏度和特异性,操作简便,可进行大批量样品的同时检测,在乙型肝炎的早期诊断及献血员筛选方面显示了广阔的前景。
本发明为解决上述问题采用的技术方案是分子灯标为一类茎-环结构的单链寡核苷酸探针,它的环部由一段与靶基因互补的探针序列构成,探针序列的两端是两段与靶基因无关的相互互补的臂序列,它们之间退火形成发夹型的茎。荧光基团和猝灭基团分别连接在两条臂的末端。发夹型的茎使荧光基团和猝灭基团相互接近,致使荧光基团的荧光通过能量转移而被猝灭。当有与之完全匹配的靶基因存在时,分子灯标的探针序列与靶基因特异性结合,形成探针-靶杂交体,迫使荧光基团和猝灭基团相互远离,体系荧光复原。由于未杂交的分子灯标仍保持原来的发夹结构,而不发射荧光,所以在检测探针的杂交作用时无需将探针-靶杂交体与过剩的分子灯标分离。
本发明的检测方法如下(1)血清样品中乙型肝炎病毒DNA的提取;(2)在分子灯标探针的存在下,对提取的乙型肝炎病毒DNA进行PCR扩增;(3)测定PCR反应体系的荧光强度,判定标本中是否存在乙型肝炎病毒。
本发明的关键在于设计合适的分子灯标探针探针的靶序列位于乙型肝炎病毒基因序列保守区,该探针适用于四种乙型肝炎亚型
(adr、adw、ayr、ayw),并具有典型的温度变性及复性特征和良好的特异性。5’端用FAM标记,3’端用DABCYL标记,设计借助于<NucleicAcidHybridization>程序及<NucleicAcidFolding>程序完成(http∥)。
其序列为FAM-5’-CGAGCATCTTCTGCGACGCGGGCTCG-3’-DABCYL(划线部分为发夹的茎部,未划线部分为与靶序列特异性互补的探针序列),其空间结构如下
同时,考虑到Mg2+无论是对PCR扩增,还是对分子灯标发夹结构及分子灯标-靶杂交体的稳定性都有较大的影响,所以有必要选择最佳的Mg2+浓度范围。通过一系列实验,本发明确定Mg2+浓度在1mmol/L-8mmol/L之间为宜。
本发明用分子灯标荧光探针进行PCR乙型肝炎病毒检测的试剂盒包括1×PCR反应缓冲液(10mmol/LKCl,8mmol/L(NH4)2SO4,10mmol/LTris-HCl,,NP-40),,,dTTP,dCTP,dGTP,、下游引物,,。
本发明用分子灯标荧光探针进行PCR乙型肝炎病毒检测具有以下优势(1)分子灯标探针操作简便,通过简单的荧光测定即可完成PCR产物的检测,避免了琼脂糖凝胶电泳的繁琐操作,适用于大批量血清的同时检测。
(2)琼脂糖凝胶电泳-溴化乙锭(EB)染色法中所用的EB是一种强致癌物质,操作不慎易对人体造成伤害,且试验完成后带有EB的琼脂糖凝胶处理起来较为繁琐。而分子灯标探针则为一段无任何生物活性的寡核苷酸链,不会对人体造成任何伤害。
(3)该方法具有极高的检测灵敏度,可轻易地检测出每毫升血清中几十个乙型肝炎病毒拷贝的存在。从而为其用于乙型肝炎的早期诊断及对献血员进行筛选提供了广阔的前景。
(4)由于未杂交的分子灯标不发射荧光且不对PCR产生干扰,当与荧光PCR仪联用时,分子灯标可用于PCR反应的实时监测,这样可使PCR扩增及产物检测在一个封闭的反应管内同时完成,从而有效地避免了产物的携带污染,同时可以通过反应过程中分子灯标荧光强度的变化判断是否存在扩增产物,避免了外部参照的使用,使结果的判定更为准确。由于发夹结构的存在,分子灯标与线性探针相比具有更佳的识别单碱基错配的能力,在某一温度范围内,分子灯标可与匹配的靶杂交产生强烈的荧光,而与单碱基错配的靶不产生荧光或只产生微弱的荧光。同时由于分子灯标中独特的能量转移机理的存在,DABCYL可以作为灯标中多种荧光基团的通用猝灭基团,因此可以针对不同靶基因设计合成携带有不同荧光基团的分子灯标探针。这些性质使分子灯标探针尤其适用于单碱基突变及多种靶基因的同时检测。
本发明的突出的实质性的特点和积极效果可从下述实施例中得以体现,但是它们并不是对本发明作任何限制。
具体实施例方式
下面结合具体实施例,进一步详细地阐述本发明。
实施例1在该实施例中,比较当PCR反应液中含有不同Mg2+浓度时分子灯标的检测效果,确定出PCR反应液中Mg2+的浓度。
分别以正常人血清及含有乙型肝炎病毒的人血清为阴性及阳性模板(血清样品的处理方法见下面实施例)进行一系列的PCR扩增反应。其中Mg2+,其它PCR反应成分如下1×PCR反应缓冲液(10mmol/LKCl,8mmol/L(NH4)2SO4,10mmol/LTris-HCl,,NP-40),,,dTTP,dCTP,dGTP,、下游引物(见下面实施例),,,2μl模板。
按如下条件进行PCR扩增PCR反应完成后,在室温下用75μlPCR反应缓冲液(含有对应浓度的MgCl2)将反应液稀释到100μl,加入微量荧光比色池中在荧光分光光度计(Ex=490nm,Em=)上测定体系荧光强度。
结果表明当Mg2+浓度低于1mmol/L及高于8mmol/L时,阳性模板及阴性模板的
PCR体系的荧光差别不大。而在1-8mmol/L之间,阳性模板及阴性模板的PCR体系的荧光强度差别明显,所以Mg2+的浓度选择在1-8mmol/L之间。
实施例2将本发明配制如下试剂盒其原料选用如下分子灯标探针探针的靶序列位于乙型肝炎病毒基因序列保守区,该探针适用于四种乙型肝炎亚型(adr、adw、ayr、ayw),并具有典型的温度变性及复性特征和良好的特异性。5’端用FAM标记,3’端用DABCYL标记。
其序列为FAM-5’-CGAGCATCTTCTGCGACGCGGGCTCG-3’-DABCY委托上海申友生物技术有限公司合成。
PCR引物扩增片段包含有分子灯标探针靶序列,扩增片段长度为180bp,由大连宝生物工程有限公司合成,序列为上游引物5’-CACCAAATGCCCCTATCTTA-3’下游引物5’-GTTTCCCACCTTATGAGTCC-3’。
Taq酶购自上海生工生物工程公司,浓度5U/ul。附10×PCR反应缓冲液(100mmol/LKCl,80mmol/L(NH4)2SO4,100mmol/LTris-HCl,,NP-40)及MgCl2溶液(浓度为25mmol/L)。
dNTPs(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)购自上海生工生物工程公司,浓度100mmol/L样品来源血清样品分别由天津医科大学药学院及南开大学卫生院提供。
PCR薄壁反应管购自上海生工生物工程公司,规格200ul。
化学试剂NP-40Fluka进口分装。
试剂盒成分如下1×PCR反应缓冲液(10mmol/LKCl,8mmol/L(NH4)2SO4,10mmol/LTris-HCl,,NP-40),,,dTTP,dCTP,dGTP,、下游引物,,。
检测步骤如下(一),将95μl人血清与5NP-40充分混合,在56℃水浴中温育1小时后,在沸水中煮8分钟,最后以10000r/min离心5分钟。取上层清液作为PCR反应的模板。
(二)PCR扩增反应(1)PCR反应混合液将2μl上述处理的血清样品作为模板加入到试剂盒中进行PCR扩增,扩增反应液总体积为25μl,成分如下1×PCR反应缓冲液(10mmol/LKCl,8mmol/L(NH4)2SO4,10mmol/LTris-HCl,,NP-40),,,dTTP,dCTP,dGTP,、下游引物,,,2μl模板。
(2)PCR扩增条件(一)结果判定(1)PCR反应液荧光强度的测定PCR反应完成后,在室温下用75μlPCR反应缓冲液()将反应液稀释到100μl,加入微量荧光比色池中在荧光分光光度计(Ex=490nm,Em=)上测定体系荧光强度。
(2)结果判定以正常血清标本为阴性对照,将它们荧光强度的平均值加上
4倍标准偏差作为判定标准,把荧光强度高于此标准(F=)的血清样品判定为乙型肝炎病毒感染的血清,而将低于此标准的判定为正常血清。
试剂盒专一性的确定分别将正常人血清、携带有乙型肝炎病毒的人血清、携带有丙型肝炎病毒的人血清及携带有戊型肝炎病毒的人血清进行乙型肝炎病毒DNA提取后取2μl上层清液试剂盒中作为PCR反应的模板,以2μl水为阴性参照进行PCR扩增,按上面提到的方法进行检测。结果表明,除携带有乙型肝炎病毒的血清标本产生了较强的荧光外,其余的四个反应体系的荧光强度均在判定标准以下,被判定为阴性,说明试剂盒具有很好的专一性。
另外,将等量的含乙型肝炎病毒的血清与含丙型肝炎病毒的血清混合作为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒共感染血清,将等量的含乙型肝炎病毒的血清与含戊型肝炎病毒的血清混合作为乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒共感染血清,将等量的含丙型肝炎病毒的血清与含戊型肝炎病毒的血清混合作为丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒共感染血清,将等量的含乙型肝炎病毒的血清、含丙型肝炎病毒的血清及含戊型肝炎病毒的血清混合作为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒共感染血清,分别以这四种血清按上述方法进行检测。结果发现,除丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒共感染血清的荧光强度低于检测标准外,其它三种血清样本均可使分子灯标产生较强的荧光,且荧光强度与乙型肝炎病毒单独感染的血清相当。这说明分子灯标可用于混合感染的血清中乙型肝炎病毒的检测,而不受共存的其他病毒干扰。
试剂盒检测血清中乙型肝炎病毒的敏感性将已知病毒数目的阳性血清用正常人血清进行10倍连续稀释,分别按上面提到的方法进行检测,结果发现荧光强度随血清中病毒拷贝数的增多呈现出逐渐增大的趋势,当血清中乙型肝炎病毒达到16拷贝/ml时,荧光强度即可达到检测标准之上,当血清中乙型肝炎病毒达到160拷贝/ml时,荧光强度明显高于检测标准,由此可见,将PCR扩增与分子灯标检测相结合,可检测出每毫升血清中30个以上病毒拷贝的存在。与琼脂糖凝胶电泳-溴化乙锭染色相比,灵敏度大大提高。
实际血清样品的测定将92临床血清样品(30个正常血清,62乙型肝炎病毒感染血清)按上面提到的方法用试剂盒进行检测,均获得了正确的检测结果。结果见下表。
其中,1-30为正常血清,31-92含有乙型肝炎病毒的血清。可见本试剂盒具有极高的灵敏度,可以检测出血清中30个以上病毒拷贝的存在,且操作简便,适用于大批量血清样品的同时检测,另外,该方法具有极高的特异性,还可用于混合感染的血清中乙型肝炎病毒的检测,而不受共存的其他病毒的干扰。
权利要求